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柿(Diospyros kaki L.)AFLP体系的建立及其优良品种指纹图谱的研究

张桂霞  
【摘要】: AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术,具有高效、快捷、稳定、可靠的特点。柿是原产我国的重要果树树种,在长期的引种和栽培过程中, 同名异物和同物异名现象严重,品种间的亲缘关系不甚明了。为给柿树的品种鉴定、种质资源保存及育种亲本选配等提供依据,本研究在建立适合柿树分析的AFLP技术体系基础上,建立了柿树部分优良品种的指纹图谱,并对其遗传多样性进行了分析。主要结果如下。 1.确定出适于AFLP分析的柿树基因组DNA提取方法为改良CTAB法,其提取液成份为:100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA,1.4mol/LNaCl, 2%CTAB, 1% PVP_(10), 100mmol/L β-巯基乙醇,10mmol/L Na_2S_2O_5。所提柿树基因组DNA纯度较高、质量较好。 2.通过对内切酶用量,酶切时间等的研究,建立了适于柿树分析的AFLP银染技术体系。在20μL的酶切体系中,含基因组DNA 450ng, NEBbuffer2 2μL,BSA 0.2μL, EcoR Ⅰ(Takala公司)3U,Mse Ⅰ(NEB公司)3U;酶切时间为3h;加入接头后,连接时间10h以上:连接产物稀释5倍后进行预扩增:预扩增产物稀秆5倍后再进行选择性扩增;加Loading buffer变性后,在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析和银染显色。 3.从64对引物组合中筛选出6对多态性高、条带清晰、分布均匀的引物组合用于材料分析,共扩增出可统计条带328条,平均每对引物扩增带数为50.5条。其中多态性条带322条,占98.2%。根据材料间的特征带和差异带,建立了60份供试材料(56个柿品种,4个君迁子类型)的指纹图。 4.应用离差平方和法对6对引物扩增的328条谱带进行聚类分析,建立了60份供试材料的AFLP树状图,结合各样品间的遗传距离(欧式距离)对其遗传多样性进行了分析,揭示了供试材料间遗传背景的相似性及复杂性,为品种鉴定和杂交育种亲本的选择,提供了理论依据。


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