柿（Diospyros kaki L.）AFLP体系的建立及其优良品种指纹图谱的研究

【摘要】： AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术，具有高效、快捷、稳定、可靠的特点。柿是原产我国的重要果树树种，在长期的引种和栽培过程中， 同名异物和同物异名现象严重，品种间的亲缘关系不甚明了。为给柿树的品种鉴定、种质资源保存及育种亲本选配等提供依据，本研究在建立适合柿树分析的AFLP技术体系基础上，建立了柿树部分优良品种的指纹图谱，并对其遗传多样性进行了分析。主要结果如下。 1．确定出适于AFLP分析的柿树基因组DNA提取方法为改良CTAB法，其提取液成份为：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA,1.4mol/LNaCl, 2％CTAB, 1％ PVP_(10), 100mmol/L β-巯基乙醇，10mmol/L Na_2S_2O_5。所提柿树基因组DNA纯度较高、质量较好。 2．通过对内切酶用量，酶切时间等的研究，建立了适于柿树分析的AFLP银染技术体系。在20μL的酶切体系中，含基因组DNA 450ng, NEBbuffer2 2μL，BSA 0.2μL, EcoR Ⅰ(Takala公司)3U，Mse Ⅰ(NEB公司)3U；酶切时间为3h；加入接头后，连接时间10h以上：连接产物稀释5倍后进行预扩增：预扩增产物稀秆5倍后再进行选择性扩增；加Loading buffer变性后，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析和银染显色。 3．从64对引物组合中筛选出6对多态性高、条带清晰、分布均匀的引物组合用于材料分析，共扩增出可统计条带328条，平均每对引物扩增带数为50.5条。其中多态性条带322条，占98.2％。根据材料间的特征带和差异带，建立了60份供试材料(56个柿品种，4个君迁子类型)的指纹图。 4．应用离差平方和法对6对引物扩增的328条谱带进行聚类分析，建立了60份供试材料的AFLP树状图，结合各样品间的遗传距离(欧式距离)对其遗传多样性进行了分析，揭示了供试材料间遗传背景的相似性及复杂性，为品种鉴定和杂交育种亲本的选择，提供了理论依据。