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《河北农业大学》 2004年
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草莓(Fragaria ananassa Duch.)原生质体培养及植株再生研究

张学英  
【摘要】:草莓是一种经济价值较高的多年生草本果树,栽培品种多为八倍体,遗传上高度杂合,而资源丰富的野生草莓倍性较低,与栽培品种差异较大,因此很难在常规育种中直接利用。原生质体操作能够扩大遗传重组范围,促进远缘性状的转移,对于有效获得新种质并应用于育种实践有着重要意义。 本试验用草莓不同基因型花药诱导愈伤组织并建立了悬浮细胞系,对影响草莓叶肉、愈伤组织及悬浮细胞系原生质体分离、培养的因素进行了研究,以建立草莓原生质体再生体系,并对培养过程中材料的遗传变异进行了探讨,为应用原生质体操作进行草莓品种改良和理论研究奠定基础。 1.建立了由草莓花药诱导胚性愈伤组织的技术体系。愈伤组织的诱导效果受低温预处理、材料的基因型、植物生长调节剂种类、浓度及配比等因素的影响。将在4℃条件下预处理2d的草莓花药接种在MS+0.5~1.0mg/L 2,4-D+1.0~2.0mg/L BA+1000mg/L KNO_3的诱导培养基上,获得的愈伤组织转入含较高水平2,4-D(2.0~4.0mg/L)的MS培养基上增殖,选择淡黄色、质地疏松的愈伤组织转入提高渗透压和NO_3~-/NH_4~+比值并降低2,4-D浓度的培养基上,得到了胚性愈伤组织。在胚性愈伤组织的继代培养基中附加CH、Gln和ME等物质,并根据其生长状态调整培养基的成分,对愈伤组织有选择地进行继代,利于保持其胚性状态。 2.试验对影响悬浮细胞生长的因子如培养基中植物生长调节剂组成、初始接种量和继代时间等进行了优化。当胚性愈伤组织继代10~15d后,挑选浅黄色、结构松脆、小颗粒状的胚性愈伤组织转入附加2,4-D(0.5mg/L)、NAA(0.5mg/L)及ZT(0.1mg/L)的MS液体培养基中进行悬浮培养。悬浮系在继代过程中,6~8d继代一次,初始接种量以每40mL的液体培养基加入鲜重0.9g左右的培养物为宜。根据其生长状态不断调整培养基中植物生长调节剂配比,采用液体—固体—液体轮回培养方法,有助于改良培养物的质量及悬浮细胞系的保持。本试验建立了草莓栽培品种丰香、女峰、明旭、全明星和野生种新疆3号等5个基因型的稳定悬浮细胞系。 3.从组培苗叶片、胚性愈伤组织及悬浮细胞系分别分离得到了原生质体,提出了原生质体的分离纯化条件,(1)悬浮细胞系酶液组成为:CPW 13%甘露醇+0.5% PVP+0.1%MES+0.5~1.0% Cellulase Onozuka R-10+0.5% Macerozyme R-10+0.05% Pectolyase Y-23;组培苗叶片及胚性愈伤组织酶液组成为:CPW13%甘露醇+0.5%PVP+0.1%MES+1.0% Cellulase Onozuka R-10+1.0% Macerozyme R-10+0.1% Pectolyase Y-23。(2)在低速(35~40rpm)恒温摇床上酶解12h,可以得到高产量和高活力的原生质体。(3)草莓原生质体纯化时以80g离心6~8分钟效果较好。(4)不同的基因型材料,材料的不同生理状态,甚至同一基因型不同的材料来源都对原生质体的产量及活力有着明显的影响。 4.优化了原生质体再生愈伤组织的培养基,其组成为:KMsP+葡萄搪0.smol/L十 CH400rng/L+Gln 300mg/L+ME 50Omg/L+2,4一D l.om留L+BA 1.omg/L。密度为1.0X l护/mL的液体浅层培养方法适合于草毒原生质体的培养。在培养过程中,降压有利于原生 质体再主细胞团的生长和发育。悬浮细胞原生质体培养3一4d出现第一次分裂,20d可形成 多细胞团,40一50d形成肉眼可见的小愈伤组织。组培苗叶片及愈伤组织原生质体仅分裂 1一3次,未能形成多细胞团。由全明星、明旭、新疆3号等3种基因型的原生质体再生了 愈伤组织。 5.将液体浅层培养获得的原生质体再生愈伤组织转到固体培养基上进行分化培养, 结果表明,以MS为基本培养基,逐步提高TDZ浓度(0.2一1 .0~2.smg/L)的处理较其 它处理具有较高的分化频率。本试验到目前获得了全明星、明旭等2种基因型的原生质体 再生植株。 6.利用PEG结合高pH、高钙法诱导明旭草毒的悬浮细胞系原生质体与黄毛草墓的叶 肉原生质体融合,从PEG不同浓度、不同处理时间以及不同原生质体密度对草葛原生质体 融合的影响等方面优化了融合条件。6一8d时观察到第一次细胞分裂,25一30d形成多细胞 团,继续培养,多细胞团逐渐褐化死亡。 7,对悬浮细胞系及其原生质体再生愈伤组织、再生植株的染色体数目观察表明,本 试验中各基因型的悬浮培养物除具有外植体倍性细胞外,还产生了大量其它倍性的细胞, 形成了多倍性细胞嵌合的细胞系。在悬浮细胞培养中倍性变化较小的明旭和全明星的原生 质体再生愈伤组织sx倍性的细胞仍占较大比例,并且能再生植株,再生植株全部为八倍 体。悬浮细胞系及原生质体再生愈伤组织的染色体倍性变化影响植株再生。 8.用50个引物对全明星和明旭的母株叶片、悬浮细胞系、再生植株叶片以及女峰的 母株叶片、悬浮细胞系为试材,进行了DNA水平变异的检测。其中全明星和明旭的各材 料均未获一得多态性条带,女峰的两种材料获得多态性引物16个,占总引物数的32%,检 测到多态性位点为30个,经统计分析认为二者的相似系数为0.930,差异座位占13.04%。 DNA水平的变异可能是女峰悬浮细胞系原生质体培养不能再生的重要原因。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S668.4

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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2 李耀中 记者 潘国义;马来西亚订走50吨双流冬草莓[N];成都日报;2008年
3 本报通讯员 刘凤珍 高秀光 本报特派记者 帅勇;句容 草莓别样红[N];南京日报;2009年
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9 赵玉龙 本报记者 刘立杉;二道岭的草莓招人稀罕[N];辽宁日报;2009年
10 YMG记者 滕新书 实习生 王嫣;烟台草莓能否再现辉煌?[N];烟台日报;2009年
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