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《河北农业大学》 2004年
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小麦—叶锈菌互作体系激发子的分离纯化及cDNA-AFLP分析

王芹  
【摘要】:近年来的研究表明,寄主与病原物互作表现感病还是抗病,不单取决于防卫反应的有无,更在于防卫反应表达的时间、空间和强度上的差异。寄主与病原物的相互识别是诱发防卫反应的第一步,因此对识别的原初信号分子—激发子(elicitor)的研究日益受到重视。已经证明,小麦—叶锈菌互作,无论亲合互作还是不亲合互作的细胞间隙液(intercellular washing fluids,IWF)中都有激发子的存在。本试验采用小麦抗叶锈近等基因系TcLr19和Thatcher,与叶锈菌生理小种99-5-49-4组成亲和程度不同的组合。不亲和组合(TcLr19×99-5-49-4)于接种后第三天,亲和组合(Thatcher×99-5-49-4)于接种后第五天,用真空渗入重蒸馏水法提取IWF,分别记作IWF_(19)和IWF_(Th),同时以不接菌的健叶提取的IWF作为对照,分别记作IWF_(CK1)和IWF_(CK2)。IWF经硫酸铵粗沉淀后,将蛋白沉淀用重蒸水重新溶解后进行凝胶过滤柱层析,以280nm紫外吸收检测、收集不同的蛋白峰,分别注射到健康的Thatcher叶片中,以苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、过氧化物酶(peroxidase,PO)防卫反应作为评价诱导活性的指标,检测活性成分(激发子)在各部分中的分布和诱导活性的强弱。 实验结果表明:不同亲和性来源的IWF经凝胶过滤柱层析后,活性强度具有一定的差异。亲和组合的收集峰1(P1)、收集峰2(P2)诱导活性比较高,而收集峰3(P3)组分则对PAL活性表现出抑制作用;不亲和组合的收集峰1(P1)对PAL酶诱导活性比较高。 利用RNA水平上的表达差异同样可以检测寄主与病原物互作的情况。本试验将上述试验体系,即TcLr19×99-5-49-4(不亲和组合)和Thatcher×99-5-49-4(亲和组合),于接种后12h,24h,36h,48h,60h,72h和120h分别剪取接菌小麦叶片和健康对照,提取叶片组织总RNA,利用与mRNA5端互补的锚定引物反转录成cDNA,通过cDNA-AFLP技术对病原物诱导的基因表达进行差异比较。 结果发现,凝胶电泳显示的差异性条带可分为两种,一种作为小麦品种基因之间的差异,可以在12-120h持续的本底水平表达;另一种作为小麦叶锈菌诱导表达的基因产物,在接种后12h即有差异条带出现,差异表现持续到36h。将获得的差异条带回收,并在对应的基本相同条件下回扩以便进行后继工作,如Northern杂交检测、cDNA文库构建、克隆、亚克隆、测序等。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S435.12

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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