链霉菌Men-myco-93-63抗生素的提取纯化及生防制剂的研究
【摘要】：链霉菌Men-myco-93-63是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离出的一种对多种植物病原菌有抑制作用的生防链霉菌。本文的主要目的是对该菌株产生的抗生素进行分离纯化，确定其结构，建立抗生素中试提取工艺及开发出合理的生物农药剂型。
首先采用了以棉花黄萎病菌，马铃薯疮痂病菌为指示菌的平皿筛选模型，对发酵液中的活性成分进行筛选。发酵液经无机沉淀剂预处理，选用HZ803吸附树脂吸附，洗脱液经等体积的乙酸乙酯萃取获得抗生素粗品。对获得的抗生素粗品以240 nm为检测波长，利用Nova-Pak C18(WATERS)7.8mm×300mm 6um反相柱，流速：2.0 mL／min，应用30％—80％—100％甲醇对抗生素粗品进行梯度洗脱。活性测定表明所获得的13个组分对马铃薯疮痂病菌均有有抑制作用，其中有7个组分对棉花黄萎病菌有抑制作用。在上述分析色谱的基础之上，应用制备液相以240 nm为检测波长，流速：15 mL／min，应用70％—70％—100％甲醇对抗生素粗品进行分离，得到7个峰，其中峰Ⅵ经光谱图比较与组分13同质，同时对峰Ⅵ进行制备。对收集的峰Ⅵ，又经94％甲醇等度分离收集其中的主峰(6—B)。将主峰(6—B)40℃减压浓缩，冷冻干燥获得一淡黄色油滴，经UV、MS、NMR、IR分析确定其为一分子量为390，分子式为C_(24)H_(38)O_4的脂类化合物。
另外，建立了该菌株的抗生素中试提取工艺流程，该流程包括以下步骤：1)发酵液的预处理和固液分离：0.08％聚丙烯酰胺对发酵液进行絮凝预处理，4000 rpm，离心20 min后过滤，将滤液pH调节到4。2)浓缩提取：发酵滤液经80℃减压浓缩，经甲醇溶解过滤，去除沉淀。3)粗品获得：甲醇溶解液中滴加10％乙醇，去除沉淀，滤液40℃减压浓缩获得抗生素粗品。并以获得的抗生素粗品为原药，制做了两种生防制剂—乳油和聚醋酸乙烯酯(白乳胶)颗粒剂。乳油制剂经室内平皿试验，证明对棉花黄萎病表现明显的抑制作用，其1000倍稀释液对蔬菜根结线虫拥有明显的杀伤作用，对根结线虫的24h后校正死亡率为30.3％。聚醋酸乙烯酯(白乳胶)颗粒剂经室内试验对蔬菜根结线虫拥有明显的杀伤作用，其对24h后蔬菜根结线虫的校正死亡率为41.9％。
【关键词】：链霉菌 农用抗生素 提取纯化 生防制剂 【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S476
【目录】：
- 1 引言8-10
- 2 材料和方法10-19
- 2.1 试验材料10-11
- 2.1.1 供试菌株10
- 2.1.2 供试培养基10
- 2.1.3 供试试剂和主要仪器10-11
- 2.2 MEN-MYCO-93-63抗生素的提取分离11-15
- 2.2.1 发酵液的制备11
- 2.2.2 Men-myco-93-63活性代谢产物的分布情况11-12
- 2.2.3 抗生素粗品的获得12
- 2.2.4 应用高效液相色谱对抗生素进行精制12-13
- 2.2.5 对组分13的精制13-14
- 2.2.6 组分13的结构鉴定和理化性质14
- 2.2.7 组分13抗菌谱的测定14-15
- 2.3 MEN-MYCO-93-63抗生素中试提取工艺及生防制剂的研究15-19
- 2.3.1 抗生素中试提取及生防制剂流程图15
- 2.3.2 应用絮凝剂对发酵液进行预处理15-16
- 2.3.3 pH对发酵液中抗生素稳定性的影响16
- 2.3.4 中试提取工艺获得的抗生素粗品HPLC分析16
- 2.3.5 生防制剂-颗粒剂的制作16-17
- 2.3.6 生防制剂-乳油的制作17
- 2.3.7 两种生防制剂生物活性的测定17-19
- 3 结果分析19-33
- 3.1 链霉菌MEN-MYCO-93-63抗生素的分离19-30
- 3.1.1 链霉菌Men-myco-93-63抗生素的分布情况19
- 3.1.2 抗生素粗品的获得19
- 3.1.3 高效液相分析19-26
- 3.1.4 制备液相峰Ⅵ和Ⅶ的精制26-27
- 3.1.5 峰Ⅵ和Ⅶ纯度测定27-28
- 3.1.6 峰Ⅵ和Ⅶ的生物活性测定28
- 3.1.7 组分13(峰Ⅵ)的结构分析28-29
- 3.1.8 组分13(峰Ⅵ)抗菌谱的测定29-30
- 3.2 MEN-MYCO-93-63抗生素提取工艺及生防制剂的研究30-33
- 3.2.1 应用絮凝剂对发酵液进行预处理30
- 3.2.2 pH对发酵液中抗生素稳定性的影响30-31
- 3.2.3 中试提取工艺获得抗生素粗品的HPLC图31
- 3.2.4 两种生防制剂活性测定31-33
- 4 讨论33-37
- 4.1 关于农用抗生素的筛选模型33-34
- 4.2 关于发酵液中抗生素的分离、提取及结构鉴定技术34-35
- 4.3 关于抗生素的中试提取工艺35-36
- 4.4 下一步工作36-37
- 4.4.1 分离纯化该菌株的其它活性代谢产物36
- 4.4.2 探索这两种剂型的稳定性和理化性质及田间防效36-37
- 5 结论37-38
- 参考文献38-42
- 附图42-50
- 在读期间发表的学术论文50-64
- 作者简介64-65
- 致谢65
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