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《河北农业大学》 2004年
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小麦抗叶锈基因Lr35成株抗性的差异表达研究

陈云芳  
【摘要】:小麦抗叶锈基因Lr35最初来源于斯卑尔脱小麦(Triticum speltoides),通过与T.monococcum的二倍体回交将其转移到小麦品种马奎斯(Marquis)中,位于2B染色体上,该基因与Sr39紧密连锁,其抗性在二叶期开始表达,六叶期后完全表达,是一个应用潜力很大的抗病基因。因此开展Lr35成株抗性基因的表达研究对于了解小麦的抗病机制、克隆抗病基因、合理利用该基因均具有重要的意义。 本研究借助于cDNA-AFLP技术,以Thatcher为感病对照,研究小麦抗叶锈基因Lr35不同叶期,接菌后不同时间内的基因表达差异。获得如下结果: 1.建立了一套适合于小麦cDNA研究的cDNA-AFLP分析的最优化体系及反应程序。通过以小麦cDNA为模板,对AFLP选扩反应体系进行摸索和优化试验。本研究所用AFLP选扩反应体系为:20μL的反应体系中含有5μL模板cDNA,2μL10×PCRbuffer,10mMdNTP0.4μL,0.6UTaqDNA聚合酶,20mM引物。反应程序:第一个循环是将小麦cDNA 94℃预变性2min;接着94℃变性30s,65℃退火30s(每个循环降-0.7℃),72℃延伸1min,循环12次;然后94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,循环23次;最后一个循环完成后,再72℃延伸2min。 2.应用96对AFLP引物对小麦抗叶锈基因Lr35的不同叶期及接种后不同时间的样品进行筛选,获得到6对能扩增出Lr35不同叶期与对照样品之间的差异表达量或差异表达条带的AFLP引物,分别是E-TG/M-CTC,E-TG/M-CAG,E-TG/M-CAC,E-TC/M-CAT,E-TG/M-CTG和E-YC/M-CAA,共得到68条差异表达的条带。 3.研究发现小麦抗叶锈基因Lr35的差异表达方式分两种:一种表达方式是基因表达量的差异,主要是引物组合E-TC/M-CAT在260bp、195bp和190bp处扩增出Lr35样品中基因的表达量随接种时间的延长而增加,而在感病对照Thatcher中没有出现表达量的增加。另一种表达方式是出现特异性条带,引物组合包括E-TG/M-CTC,E-TG/M-CAG,E-TG/M-CAC,E-TG/M-CTG和E-TC/M-CAA。特别是引物组合E-TG/M-CTG可以从小麦抗叶锈基因Lr35的二叶期到六叶期的样品中扩增出一条195bp左右的特异性条带,而在感病对照Thatcher、Lr35苗期样品和未接种的对照Lr35中缺失这条195bp的条带。该条带在Lr35二叶期样品接种后60h开始表达,三叶期样品48h开始表达,四叶期样品接种后48h开始表达,五叶期样品接种36h后开始表达,六叶期样品接种后36h开始表达,初步说明该条带为Lr35受叶锈菌诱导表达的特异性条带。 4.将所得到的68条差异表达的条带回收扩增,回扩出33条差异条带,回扩效率为49%。将回扩得到的33个差异条带样品进行反向Northern blot验证,共得到7个有显著差异的片段。其中引物E-TG/M-CTG中得到的差异条带经反向Northern blot,证明为小麦抗叶锈基因Lr35表达的特定基因片断,该研究成果为进一步进行抗病基因的克隆奠定了基础。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S435.12

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【引证文献】
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【参考文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 高倩;小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35的RGA分析[D];河北农业大学;2008年
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