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《河北农业大学》 2004年
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鸡传染性法氏囊病毒检测方法的建立

达来宝力格  
【摘要】:本试验通过SPF鸡胚和CEF细胞增殖鸡法氏囊病病毒(IBDV),吸取接毒后2~5d内死亡鸡胚的尿囊液和绒毛尿囊膜及细胞病变达到80%时的病毒细胞培养液,经反复冻融,利用氯仿沉淀病毒,聚乙二醇6000浓缩病毒,蔗糖梯密度低温超速离心和葡聚糖G—200凝胶柱过滤等方法纯化病毒,均得到了较高纯度的IBDV。将纯化的IBDV分别免疫家兔和小鼠,制备了兔抗IBDV、鼠抗IBDV的高免血清,用健康兔的血清免疫羊而获得羊抗兔免疫血清。经饱和硫酸铵、葡聚糖凝胶G—25脱盐后,获得了羊抗兔、兔抗IBDV及小鼠抗IBDV免疫球蛋白IgG的粗提物,经DEAE—32离子交换层析纯化了羊抗兔和小鼠抗IBDV的IgG。用改良的过碘酸钠法和柠檬酸三钠—鞣酸混合还原法分别制备了高纯度的羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体和胶体金标记抗体。依据方阵测定法,通过对兔抗IBDV IgG、小鼠抗IBDV IgG及标记抗体的最佳使用浓度的确定,建立了双夹心酶联免疫吸附试验(双夹心ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA)和斑点免疫金银染色法(Dot—IGSS)等3种用于检测IBDV抗原的免疫学方法。双夹心ELISA方法的包被抗体的最适浓度为1:100,兔抗IBDV的最佳反应浓度为1:200,酶标记抗体的最佳工作浓度为1:400。Dot—ELISA试验的兔抗IBDV的反应浓度为1:100,酶标记二抗的工作浓度为1:200。Dot—IGSS试验的兔抗IBDV的包被浓度为1:200,金标记抗体最适工作浓度为1:10。经重复性试验、特异性阻断及交叉性试验,结果表明3种检测方法具有特异性强、重复性高,均不与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡产蛋减少综合症病毒抗原交叉反应的优点。通过敏感性的试验及其与琼脂扩散试验(AGP)的比较得到了以下结果,即双夹心ELISA检测法氏囊病毒抗原的敏感性最高,最低检出量为0.3192μg/ml,其次是Dot—IGSS,达到0.798μg/ml,最后是Dot—ELISA,其敏感性较低,只有1.596μg/ml。我们建立的这3种方法都比AGP的敏感性高,双夹心ELISA是AGP的100倍,Dot—IGSS是AGP的40倍,Dot—ELISA是AGP的20倍。通过比较鸡法氏囊病病毒不同毒株的编码A片段的基因序列,根据Genebank上经典毒株STC的A片段上编码VP2和VP5蛋白相互重叠部分处保守序列内合成一对寡核苷酸引物,建立了检测IBDV的反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)。经特异性、敏感性和重复性试验检测IBDV抗原,均扩增出了一大小为267bp的目的核苷酸片段。其敏感性达到了1.995ng/ml,是所有检测IBDV抗原的方法里最为敏感的方法。实验也证明PCR方法有快速、准确、操作简便、敏感性高、易于判读、特异性强、重复性好等优点,是检测IBDV抗原的最快和最有效的方法,可用于大量IBDV抗原样本的检测。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S854.4

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【引证文献】
中国重要会议论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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8 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
9 方忠意;崔保安;;动物基因工程疫苗研究进展[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
2 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
3 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
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5 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
7 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
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9 孙亚妮;免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D];山东农业大学;2011年
10 邱玉玉;A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究[D];山东农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
2 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
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6 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
7 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
8 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
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10 邱莹;猪细小病毒的分离鉴定及NS1基因、VP2基因的克隆测序分析[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 王建新;J亚群禽白血病病毒感染对肉鸡生长和免疫功能的影响及其env基因的克隆[D];山东农业大学;2003年
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【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 陈悦;鸡生长与免疫抑制综合征(CSIS)流行病学研究[D];河南农业大学;2010年
【二级参考文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前7条
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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7 杜丽飞;松乳菇菌丝分离培养及其多糖药理活性的初步研究[D];湖南农业大学;2008年
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9 黄显明;Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分析及逆转录套式PCR方法的建立[D];安徽农业大学;2008年
10 苏霞;鸡传染性贫血病毒北京株的全基因组克隆及致病性实验研究[D];河北农业大学;2010年
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