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《河北农业大学》 2005年
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红色荧光蛋白基因标记荧光假单胞菌的研究

贾艳华  
【摘要】:转基因微生物(Genetically modified microorganism, GMM)在农业生产中具有重要作用,其在环境中的安全性问题倍受关注。分子生态学技术的发展为探明细菌的微生态行为提供了有效手段与技术支持。荧光假单胞菌作为重要的生防细菌,起着越来越重要的作用,因而构建良好的荧光假单胞杆菌标记系统是非常重要的。 本研究重组荧光假单胞菌工程菌BioP8的环境生态安全性结果显示:工程菌BioP8在甘蓝叶片上的总菌落密度维持在10~8CFU/cm~2左右,抗性菌落维持在10~3 CFU/cm~2左右;土壤中总菌落密度维持在10~8 CFU/g左右,抗性菌落约为10~2 CFU/g;喷洒工程菌BioP8前后叶片上的芽孢杆菌数维持在10~6CFU/cm~2;工程菌BioP8在田间的扩散情况实验结果表明,防治后30天后土壤中的总细菌数为10~8 CFU/g,超过5米的土样中没有分离出Rif/Km/Spc抗性菌落,说明BioP8的扩散能力很弱;BioP8在甘蓝植株根部的定殖实验显示抗性菌落在浸根后1天和9天各出现一高峰值,之后逐渐恢复到浸根前的水平,30天后,其在根部的密度为10~3 CFU/g;BioP8悬浮剂防治小菜蛾田间实验调查结果表明,工程菌BioP8速效性比化学农药对照差,防治后7、15天,BioP8防治区对小菜蛾的防效逐步增加,分别达46.4%和85.7%,其防治效果高于灭多威防治区;工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响调查结果表明几种主要天敌昆虫数量和对照区相当。而化防区天敌昆虫数量显著降低,施药后3、7、15天分别比对照减少68.7%、62.5%和36.7%。处理对甘蓝田节肢动物群落存在不同的影响,调查区甘蓝田节肢动物物种个体丰富度有所不同,害虫丰富度依次为空白对照区化防区工程菌BioP8防治区;天敌个体丰富度依次为工程菌BioP8防治区空白对照区化防区,化学农药对天敌的影响较大,而生防区害虫的数量保持在较低的水平,蜘蛛和天敌均高于化防区;工程菌对甘蓝的生长发育及其它病害发病情况调查结果表明,工程菌BioP8在甘蓝田中不会诱发霜霉、软腐等甘蓝常见病害,也不会对甘蓝产生致病性药害,对甘蓝的生长发育也无不良影响,其长势和化学农药区相当,明显好于空白对照区。 用昆虫消化液处理RFP(red fluorescent protein, RFP)结果表明RFP在昆虫消化液中能抵抗蛋白酶的作用,RFP在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中非常稳定,仍发出正常的红色荧光。这也证明了RFP稳定性很强,这些特性将能很好的应用于Cry蛋白在害虫中肠的定位和作用机理等方面的研究。 构建了含有红色荧光蛋白基因表达盒的质粒载体pJH3。将rfp基因表达盒分别插入Mini-Tn5转座子和插入到大肠杆菌—荧光假单胞菌穿梭载体pSPCPα-1ac中,得到质粒载体pJH4和pJH5。之后将rfp基因整合到荧光假单胞菌P303和其工程菌BioP8中,分别得到8’P303,8’BioP8;将pJH5转入P303中得到转化子12P303。质粒标记工程菌在366nm紫外光下发出强烈的
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S476.1

【引证文献】
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【共引文献】
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6 赵立平;;分子生态学与微生物群落的动力学监测、结构解析及功能调控[A];微生物生态学研究进展——第五届微生物生态学术研讨会论文集[C];2003年
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【同被引文献】
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2 王晓飞;薛春生;徐书法;刘力行;陈捷;;玉米弯孢菌黑色素性质及其在致病性中的作用研究[J];安徽农业科学;2007年21期
3 朱育菁,刘波,葛慈斌,林营志,曹宜;青枯病生防菌ANTI-8098A菌株发酵过程氨基酸变化动态的研究[J];氨基酸和生物资源;2004年03期
4 康绍兰;张浩;黄梧芳;郭丽娟;胡启德;;诱发玉米抗小斑病突变体的研究 Ⅲ、影响玉米小斑病菌致病毒素作用的因素与生物测定[J];河北农业大学学报;1986年03期
5 石洁,刘玉瑛,刘爱国,王连生;河北省玉米弯孢霉菌叶斑病发生调查[J];河北农业大学学报;1998年02期
6 曹宜,刘波,朱育菁,葛慈斌;青枯病生防菌ANTI-8098A菌株生物学特性的研究[J];福建农业学报;2003年04期
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【二级引证文献】
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3 李存才;不明病原将“原形毕露”[N];中国财经报;2005年
4 熊蕾;瑞卡达:为生物安全呐喊[N];南方周末;2004年
5 铁铮;基因工程敲响生物安全警钟[N];中国绿色时报;2004年
6 白秀萍;日本制定国家战略 保障林业生物安全[N];中国绿色时报;2009年
7 特派记者 周元 陈成智 谭丽琳;生物安全成南繁最大威胁[N];海南日报;2009年
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