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《河北农业大学》 2005年
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枣总RNA提取及mRNA差异显示技术体系的建立

刘中成  
【摘要】:枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国重要的特色果树,本试验以高抗枣疯病种质“抗疯一号”以及感病品种婆枣为试材,采用不同方法对其组培苗、幼叶、幼嫩枝皮、根皮和枣果总RNA进行了提取和鉴定,并比较分析了RNA适宜的保存及电泳检测条件,建立了适合枣的mRNA差异显示技术体系,旨在为进一步进行枣分子生物学研究及筛选克隆抗枣疯病基因片段,揭示抗枣疯病的分子机理奠定基础。 试验中主要比较和改进了Trizol试剂法、改良CTAB法、改进SDS-酚法、热硼酸法和异硫氰酸胍法五种常用的植物组织RNA提取方法。通过对RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面进行比较,结果表明:Trizol试剂法为组培苗RNA的最佳提取方法,所提取RNA完整,纯度较高,OD_(260)/OD_(280)=1.82,OD_(260)/OD_(230)=2.02,产率可达到55μg/g,提取时间仅为1h;改良CTAB法和改进SDS-酚法可从田间叶片中得到高质量的RNA,改良CTAB法提取的RNA纯度高于SDS-酚法,但产率却显著低于SDS-酚法;以韧皮部为试材时,几种方法均可得到高质量的RNA,改良CTAB法或SDS-酚法提取的RNA质量最高,但两种方法的产率低于Trizol试剂法;根皮RNA含量较低,且较难提取,只有SDS-酚法和改良CTAB法获得了高质量的RNA,由于SDS-酚法产率显著高于改良CTAB法,所以SDS-酚法更适合枣根部组织的RNA提取;枣果内含物较多,RNA提取相对困难,只有改良CTAB法可提取到高质量的RNA,紫外吸收值OD_(260)/OD_(280)=1.85,OD_(260)/OD_(230)=2.92,但产率只有17μg/g,这主要是因为改良CTAB法去除其它杂质过程中造成了RNA的丢失,也可能是由于枣果RNA含量低的原因。试验中发现,改良CTAB法在组培苗、幼叶、幼嫩枝皮、根皮及枣果等组织中均可得到高质量的RNA和完整的DNA,可以同时满足DNA和RNA的实验。所以对CTAB法中CTAB、β-巯基乙醇、PVP和糖原等四种关键物质浓度进行了调整,得到总RNA提取最佳体系为:2%CTAB,4mol/L异硫氰酸胍,2.0mol/LNaCl,100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA(pH8.0),2%PVP,4%β-巯基乙醇,250μg/ml糖原。 RNA提取时,枣组织材料在不同温度下的最长保存时间为:4℃,10d;-20℃,60d;-70℃,90d以上。离体RNA在不同溶液中的最长保存时间也不相同,-20℃时,在TE溶解液与DEPC-H_2O中的保存时间均为60d左右;在0.5%SDS溶液中可保存90d左右;去离子甲酰胺中,RNA可存保存6个月以上;-70℃时,在TE溶解液与DEPC-H_2O中可保存7个月左右,而在0.5%SDS溶液和去离子甲酰胺可保存12个月以上,由于不同溶解液中RNA提纯方式不同,所以应根据实验条件采用不同的保存缓冲液。电泳检测RNA时,高压快速(5V/cm)电泳易使RNA出现降解,本试验采用分次降低电压(5V/cm电泳10min;3V/cm电泳20min;2.5V/cm电泳10min)的方法,有效防止了由电泳方式不当导致的RNA降解。 采用在病树上嫁接健康接穗的方式使病原菌侵染接穗,通过田间观察及利用PCR技术和荧光显微技术检测植原体。嫁接后42d,抗、感接穗出现明显差异,在
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S665.1

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前2条
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2 马庆华;续九如;;枣树分子标记研究进展[J];分子植物育种;2006年S2期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 薛渝峰;赵锦;刘孟军;;cDNA—AFLP技术及其在干果研究中的应用[A];第五届全国干果生产、科研进展学术研讨会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 马庆华;不同产地冬枣遗传品质差异及其栽培技术研究[D];北京林业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 赵彦檩;枣谷胱甘肽转移酶的克隆、表达及其与枣疯病相关性研究[D];河北农业大学;2011年
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【参考文献】
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【共引文献】
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2 魏国芹;戴洪义;孙玉刚;梁美霞;安淼;;榅桲离体培养繁殖的研究[J];山东农业科学;2010年01期
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9 张霞;刘敦菊;徐立;眭顺照;李名扬;;白兰叶挥发油提取方法及工艺条件研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年03期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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8 齐靖;申连英;毛永民;曹柳青;兰海波;陈亮;;枣转基因研究前景展望[A];第五届全国干果生产、科研进展学术研讨会论文集[C];2007年
9 张伟;王玖瑞;刘孟军;周俊义;;枣花蕾蛋白质双向电泳体系的建立[A];第五届全国干果生产、科研进展学术研讨会论文集[C];2007年
10 马艳芝;张玉星;;梨属植物基因组DNA提取部位对RAPD扩增的影响[A];第二届全国果树分子生物学学术研讨会论文集[C];2009年
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1 赖晓芳;中国对虾应答WSSV侵染相关基因的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 王发明;柚(citrus grandis Osbeck)单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立[D];福建农林大学;2010年
3 生书晶;何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年
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5 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
6 郝金凤;无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育[D];内蒙古大学;2010年
7 杜振国;三种水稻病毒基因沉默抑制子的鉴定和研究[D];福建农林大学;2011年
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9 李娟;安吉白茶高氨基酸性状相关基因的全长cDNA克隆及功能的初步研究[D];湖南农业大学;2011年
10 温景辉;基于SSR分子标记的山葡萄种质遗传多样性研究与核心种质构建[D];吉林农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张庆福;枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化烟草提高抗脱水研究[D];华中农业大学;2010年
2 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
3 杨堃;鹅CYP7A1基因克隆、表达调节及表达规律的研究[D];华中农业大学;2010年
4 闫恒超;棉花纤维发育伸长期和次生壁加厚期数字表达谱分析[D];华中农业大学;2010年
5 王国栋;利用微阵列技术筛选大白猪和二花脸猪经产母猪排卵卵泡差异表达基因[D];华中农业大学;2010年
6 张鲁军;离子束诱导普通小麦小偃81 HMW-GS 1Ax1缺失突变家系突变机制研究[D];郑州大学;2010年
7 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
8 于军伟;苹果α-法尼烯合成酶基因转化番茄研究[D];山东农业大学;2010年
9 袁园园;小麦骨干亲本碧蚂4号的性状与遗传特点分析[D];山东农业大学;2010年
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 陈淑芹,孙治强,王兰菊,陈之群;清洗液对夏白菜中农药残留洗除效果的对比试验[J];安徽农业科学;2004年02期
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4 李瑞环;李新岗;黄建;高文海;张亚利;;枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化[J];安徽农业科学;2007年17期
5 刘志静;易图永;冯洁;;植物抗病基因的研究进展[J];安徽农业科学;2008年13期
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7 马福广,齐金玉;冬枣在大连地区的表现[J];北方果树;2000年02期
8 张道辉,苑克俊,王明三,公维富,包西全;冬枣的主要品种及其贮藏条件[J];北方果树;2000年04期
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10 杜希华,陆海,高述民,李凤兰;文冠果花药总RNA提取方法研究[J];北京林业大学学报;2003年01期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 刘孟军;;RAPD技术在枣和酸枣种质鉴定上的应用研究[A];中国科学技术协会第二届青年学术年会园艺学论文集[C];1995年
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中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 鹿金颖;枣自然授粉实生后代杂种鉴定及遗传变异研究[D];河北农业大学;2003年
2 张今今;中国葡萄属野生种抗白粉病基因cDNA克隆及序列分析[D];西北农林科技大学;2003年
3 刘贯山;蚕豆CDPK基因克隆、表达分析和玉米V-ATPase A亚基磷酸化位点鉴定[D];中国农业大学;2004年
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5 李守勇;不同产地冬枣品质特性及其遗传变异研究[D];北京林业大学;2004年
6 李颖岳;引进台湾青枣品种设施栽培的对比研究[D];北京林业大学;2005年
7 申连英;枣(Ziziphus jujuba Mill.)遗传连锁图谱构建及性状的QTL定位研究[D];河北农业大学;2005年
8 朱华国;棉花体细胞胚胎发生形态、遗传分析及初始脱分化相关基因的克隆与表达分析[D];华中农业大学;2009年
9 游常军;OsIRL基因家族分析及开花基因的功能研究[D];华中农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴臻;枣种质资源的RAPD研究与分析[D];陕西师范大学;2002年
2 杨丽娜;cDNA-AFLP改良法分离草菇低温诱导表达基因和草菇ras启动子的克隆[D];华南热带农业大学;2003年
3 赵智慧;冬枣、临猗梨枣果实发育及品质的形成[D];河北农业大学;2003年
4 施征;三个枣品种抗寒生理特性的研究[D];河北农业大学;2003年
5 金竹萍;枣离体胚培养及离体受精技术的研究[D];山西大学;2003年
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7 邱杨;小白菜耐盐性的遗传分析与耐盐相关基因的差异表达研究[D];中国农业科学院;2004年
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 李粲;滕峥;刘开雨;桑洪玉;卢双楠;方位宽;梁朝旭;刘晓静;何姗珊;刘芳;邱永福;李鸣;李容柏;;甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析[J];南方农业学报;2012年06期
2 文亚峰;原勤勤;何钢;;枣树分子育种研究进展[J];经济林研究;2010年02期
3 马庆华;李永红;梁丽松;王海;许元峰;孙玉波;王贵禧;;冬枣优良单株综合评价体系的建立[J];农业系统科学与综合研究;2011年03期
4 李文尧;姚立新;吴宝凤;;滨海盐碱地黄骅冬枣速生丰产栽培技术[J];黑龙江农业科学;2012年07期
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9 谢永波;冯殿齐;赵进红;王利;王玉山;罗磊;牛庆霖;周光锋;;基于AFLP技术的枣树主栽品种亲缘关系的研究[J];中国农学通报;2014年13期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 文亚峰;原勤勤;何钢;;枣树分子育种研究进展[A];第二届中国林业学术大会——S9 木本粮油产业化论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
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中国硕士学位论文全文数据库 前5条
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【二级参考文献】
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【相似文献】
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2 聂翠蓉;RNA:纵是配角也精彩[N];科技日报;2009年
3 伊瑶;RNA干扰技术成明日黄花?[N];医药经济报;2011年
4 王小龙;科学家发现控制个体稳定的RNA片段[N];科技日报;2009年
5 本报记者 衣晓峰 聂松义 通讯员 陈英云;微小RNA揭开心律失常之谜的“金钥匙”[N];健康报;2010年
6 冯卫东;RNA干扰机制首次在人体中获得证实[N];科技日报;2010年
7 记者 常丽君;新RNA转录变体可简化生物线路[N];科技日报;2011年
8 记者 聂翠蓉;细胞“垃圾”也能变废为宝[N];科技日报;2008年
9 记者 刘海英;病毒会利用微RNA对人体实施攻击[N];科技日报;2010年
10 陈蕾;赛默飞世尔启动RNA干扰研究/药物筛选资助项目[N];中国包装报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 于丽;纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因治疗大肠癌的实验研究[D];中南大学;2009年
2 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
3 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
4 金哲秀;RNA干扰抑制基质金属蛋白酶对小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究[D];吉林大学;2011年
5 李建华;髓样细胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究[D];复旦大学;2010年
6 孙永刚;核干细胞因子RNA干扰对HT29细胞CDX2表达的影响[D];第三军医大学;2009年
7 刘爱军;脑内冷诱导RNA结合蛋白的表达及其神经保护作用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
8 靳宇;RNA带扭结结构的组合研究[D];南开大学;2010年
9 鄂继福;应用RNA干扰技术沉默Med-19基因及其对大肠癌细胞增殖影响研究[D];第二军医大学;2010年
10 张璟;RNA干扰对XWLC-05肺癌细胞水通道蛋白3表达的影响[D];昆明医学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李喜英;黄瓜花叶病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究[D];浙江理工大学;2010年
2 王冕;棉花RNA依赖的RNA聚合酶6(GhRDR6)基因的分离及功能分析[D];山东农业大学;2011年
3 王庆晓;RNA干扰逆转HeLaB2/DDP细胞顺铂耐药的研究[D];南京大学;2011年
4 石杜娟;利用RNA干扰技术抑制日本血吸虫酪氨酸羟化酶的合成[D];安徽医科大学;2011年
5 张旭;表达猪let-7c细胞株的建立及其对猪瘟病毒的调控作用[D];西北农林科技大学;2010年
6 王少军;RNA解旋酶p68在创伤愈合中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2010年
7 丁艳杰;葡萄病毒A MP基因RNA干扰载体的构建及其鉴定[D];中国农业科学院;2011年
8 崔广迪;基于H1N1的RNA二级结构的相似性比较研究[D];吉林大学;2010年
9 孟益聪;哺乳动物细胞有丝分裂中期染色体上RNA成分的研究[D];兰州大学;2010年
10 杨娟;非编码RNA片段化方法的建立及验证[D];浙江理工大学;2010年
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