枣总RNA提取及mRNA差异显示技术体系的建立

【摘要】：枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国重要的特色果树,本试验以高抗枣疯病种质“抗疯一号”以及感病品种婆枣为试材,采用不同方法对其组培苗、幼叶、幼嫩枝皮、根皮和枣果总RNA进行了提取和鉴定,并比较分析了RNA适宜的保存及电泳检测条件,建立了适合枣的mRNA差异显示技术体系,旨在为进一步进行枣分子生物学研究及筛选克隆抗枣疯病基因片段,揭示抗枣疯病的分子机理奠定基础。 试验中主要比较和改进了Trizol试剂法、改良CTAB法、改进SDS-酚法、热硼酸法和异硫氰酸胍法五种常用的植物组织RNA提取方法。通过对RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面进行比较,结果表明:Trizol试剂法为组培苗RNA的最佳提取方法,所提取RNA完整,纯度较高,OD_(260)/OD_(280)=1.82,OD_(260)/OD_(230)=2.02,产率可达到55μg/g,提取时间仅为1h;改良CTAB法和改进SDS-酚法可从田间叶片中得到高质量的RNA,改良CTAB法提取的RNA纯度高于SDS-酚法,但产率却显著低于SDS-酚法;以韧皮部为试材时,几种方法均可得到高质量的RNA,改良CTAB法或SDS-酚法提取的RNA质量最高,但两种方法的产率低于Trizol试剂法;根皮RNA含量较低,且较难提取,只有SDS-酚法和改良CTAB法获得了高质量的RNA,由于SDS-酚法产率显著高于改良CTAB法,所以SDS-酚法更适合枣根部组织的RNA提取;枣果内含物较多,RNA提取相对困难,只有改良CTAB法可提取到高质量的RNA,紫外吸收值OD_(260)/OD_(280)=1.85,OD_(260)/OD_(230)=2.92,但产率只有17μg/g,这主要是因为改良CTAB法去除其它杂质过程中造成了RNA的丢失,也可能是由于枣果RNA含量低的原因。试验中发现,改良CTAB法在组培苗、幼叶、幼嫩枝皮、根皮及枣果等组织中均可得到高质量的RNA和完整的DNA,可以同时满足DNA和RNA的实验。所以对CTAB法中CTAB、β-巯基乙醇、PVP和糖原等四种关键物质浓度进行了调整,得到总RNA提取最佳体系为:2%CTAB,4mol/L异硫氰酸胍,2.0mol/LNaCl,100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA(pH8.0),2%PVP,4%β-巯基乙醇,250μg/ml糖原。 RNA提取时,枣组织材料在不同温度下的最长保存时间为:4℃,10d;-20℃,60d;-70℃,90d以上。离体RNA在不同溶液中的最长保存时间也不相同,-20℃时,在TE溶解液与DEPC-H_2O中的保存时间均为60d左右;在0.5%SDS溶液中可保存90d左右;去离子甲酰胺中,RNA可存保存6个月以上;-70℃时,在TE溶解液与DEPC-H_2O中可保存7个月左右,而在0.5%SDS溶液和去离子甲酰胺可保存12个月以上,由于不同溶解液中RNA提纯方式不同,所以应根据实验条件采用不同的保存缓冲液。电泳检测RNA时,高压快速(5V/cm)电泳易使RNA出现降解,本试验采用分次降低电压(5V/cm电泳10min;3V/cm电泳20min;2.5V/cm电泳10min)的方法,有效防止了由电泳方式不当导致的RNA降解。 采用在病树上嫁接健康接穗的方式使病原菌侵染接穗,通过田间观察及利用PCR技术和荧光显微技术检测植原体。嫁接后42d,抗、感接穗出现明显差异,在

【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S665.1