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《河北农业大学》 2006年
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植酸酶基因转化棉花及转基因植株再生

李秋伶  
【摘要】:本研究采用基因枪轰击转化技术,将外源植酸酶基因(PhyA)导入棉花茎尖分生组织,初步获得转基因植株;利用根癌农杆菌转化法将植酸酶基因导入棉花胚性愈伤组织,探讨农杆菌侵染棉花胚性愈伤的转化条件,并获得抗性胚性愈伤组织;通过花粉管通道法将PhyA基因导入棉花,获得经PCR检测的转基因植株。本研究旨在为棉花现代分子育种增添新的内容和新的种质材料,同时为解决农作物有效利用土壤有机磷资源开辟一条经济有效的途径。 利用棉花茎尖分生组织易于再生的特点,将含有植酸酶基因(PhyA)的质粒包裹在金粉上,轰击转化陆地棉品种农大KB18的茎尖分生组织。摸索出了一条适合茎尖再生的途径。对轰击参数进行了综合比较,优选出最佳轰击组合,确定了适合基因枪茎尖转化体系的梯度筛选法。研究认为,培养茎尖的培养基以MSB附加30%葡萄糖,不添加或添加少量激素为佳;基因枪轰击过程中,采用轰击压力1350psi,真空度28inch Hg,轰击距离9cm,轰击1次,转化效果最佳;轰击后接入加有1g·L~(-1)活性炭的MSB培养基中恢复培养4-7d,至组织长出绿芽点时,将其转入筛选培养基MSB+Kan(70、80、100、110、130、140mg·L~(-1))上进行梯度筛选,获得15株卡那霉素抗性植株。PCR分析表明有8株抗性植株含有PhyA基因,PCR-Southem杂交分析进一步证实了PhyA基因在转基因棉花基因组中的整合。从基因枪轰击到获得转化小植株大约需要3个月时间,最终转化率为2.97%。 用质粒PC-KSA2300表达单元转化农杆菌菌株EHA105的感受态细胞,构建了可直接用于遗传转化的农杆菌工程菌株。为了建立农杆菌介导的棉花转基因技术体系,用获得的农杆菌菌株侵染棉花胚性愈伤组织,摸索了影响其转化的因素。结果表明:不同棉花品种间胚性愈伤组织的生长动态和对卡那霉素的敏感性有很大差异;农杆菌侵染时间在5-10分钟、共培养时在18-21℃条件下培养1-2d,转化效果较好,通过卡那霉素筛选培养,获得抗性愈伤组织。对获得的愈伤组织进行PCR检测,初步证明PhyA基因己转入棉花基因组中。 花粉管通道法共转化棉铃1400个,最后成铃638个,结铃率为45.57%。将收获转化成铃的种子种植于温室,待其长出1片真叶时,用浓度为2000mg·L~(-1)的卡那霉素进行涂抹试验,得到抗Kan植株56株,PCR检测结果表明其中有7株含有PhyA基因。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S562

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【引证文献】
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