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《河北农业大学》 2007年
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调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的STK基因的克隆与功能分析

谷守芹  
【摘要】: 由凸脐蠕孢菌引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,MAPK信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本文利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌中的3个MAPK基因(STK1、STK2、STK3),分别与调控玉米大斑病菌的渗透胁迫调节、致病性与分生孢子发育、细胞壁合成等3种类型的已知MAPK基因有非常高的同源性。在获得玉米大斑病菌STK1基因突变体的基础上,进行了玉米大斑病菌STK1基因的表达研究,确定了STK1基因在玉米大斑病菌分生孢子发育和渗透胁迫调节方面的重要功能,为研究其他MAPK基因提供了思路和方法。经对玉米大斑病菌STK1基因反义诱导表达突变体的构建,不仅为该基因作为靶基因进行病害防治奠定基础,而且STK1基因正义诱导表达突变体的构建还将为该基因在其它物种中的转化以及研究该基因与其它基因之间的关系提供了材料。对ATMT突变体和黑色素缺失突变体中STK1基因表达的研究,证明了玉米大斑病菌调控生长和发育有着更复杂的机制。本文主要结果如下: 1.利用候选基因法克隆了3个玉米大斑病菌MAPK基因,即STK1,STK2和STK3。其中STK1和STK2基因获得了基因的cDNA全长和DNA全长,STK3基因为一个片段,获得了该基因的部分DNA序列。STK1基因cDNA全长和DNA全长的获得使前期研究获得的STK1基因片段得到完整化,并对GenBank中登录的该基因进行了更新(登录号为AY849317)。 2.对STK1、STK2和STK3基因的结构进行了分析。STK1基因DNA全长1506bp,cDNA全长1071bp,编码356个氨基酸,有9个外显子和8个内含子,外显子1071bp,内含子共435bp;STK2基因DNA全长1277bp,cDNA全长1059bp,编码352个氨基酸,含有5个外显子,4个内含子,外显子共1059bp,内含子共218bp;STK3基因片段长度为591bp,可能存在3个内含子,共172bp,4个外显子总长419bp,该基因的编码序列从该片段的第3位开始,编码区域为417bp,预测编码蛋白中含有139个氨基酸。试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。 3.对玉米大斑病菌STK1、STK2和STK3三个MAPK基因的同源性和功能进行了分析和比较,其中STK1基因可能主要与渗透胁迫和应激胁迫调节有关:STK2基因主要与病菌的致病性和孢子发育有关;STK3基因主要与细胞壁合成有关。为了明确STK1基因的表达量的变化,本试验获得了长度为1287bp的玉米大斑病菌β-微管蛋白基因片段,该序列与玉米小斑病菌的β-微管蛋白基因同源性均为100%。以该基因为内参,利用半定量RT-PCR技术,研究了高渗条件对玉米大斑病菌STK1基因表达的影响,在高渗处理8h内,STK1基因的表达量比较稳定,但超过8h后,STK1基因的表达量迅速下降。 4.在高渗胁迫条件下,玉米大斑病菌的菌落形态、颜色、生长速度发生严重变化,但STK1基因突变体则变化不明显。 5.利用原核表达载体pET28a(+)及原核表达宿主菌BL21构建了玉米大斑病菌STK1基因的原核表达载体STK1-pET28a(+),并成功进行了STK1基因的原核表达分析。为STK1蛋白的分离和在细胞中的定位研究奠定了基础。Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的STK1基因在基因组中以单拷贝形式存在。 6.在优化玉米大斑病菌原生质体制备和再生条件的基础上,根据基因同源重组原理构建了含有潮霉素磷酸转移酶基因和氨苄青霉素基因两个抗性标记的STK1基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化,获得了246个抗性转化子,通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物及STK1基因特异性引物对转化子的筛选,得到了一个STK1基因突变体,命名为STM-35。STK1基因敲除突变体STM-35的菌丝灰白色、气生菌丝少,菌落低矮,菌落中部菌丝呈浸润状,菌丝细胞中色素沉积少、菌丝较透明,没有发现分生孢子的形成,提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降,致病性分析表明,该突变体的致病性大大降低。 7.基于pSOI质粒构建了玉米大斑病菌STK1基因的反义和正义诱导表达载体,获得了30个反义转化子,其中有5个转化子为反义抑制突变体,它们与STK1基因敲除突变体的表现基本一致。在构建玉米大斑病菌ATMT突变体库的基础上,对与STK1基因突变体在菌落和菌丝形态方面非常相似、也不产生分生孢子的ATMT突变体STAM-26,进行了STK1基因的表达分析,发现该突变体中STK1基因能够正常表达,说明调控玉米大斑病菌菌丝和分生孢子发育的机制非常复杂,并不是由某一条途径单独调控。 结论推测,STK1基因对玉米大斑病菌菌丝的生长发育没有影响,但可能与菌丝中色素等物质的积累有关,并调控病菌分生孢子的发育、HT-毒素的活性和致病性。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S435.131

【引证文献】
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5 韩建民,姜丽,王惠哲,董金皋;玉米大斑病菌HT-毒素对玉米叶片木质素含量的影响[J];沈阳农业大学学报;2000年05期
6 马继芳,范永山,张静柏,董金皋;玉米大斑病菌原生质体的制备[J];河北农业大学学报;2003年03期
7 张建成,范永山,董金皋;玉米大斑病菌毒素对玉米叶肉细胞脂氧合酶活性的影响[J];植物病理学报;2003年05期
8 纪伟波;何海军;赵松涛;焉山;付东波;;黑龙江玉米大斑病菌生理分化研究[J];玉米科学;2010年01期
9 ;玉米大斑病国外文献汇编[J];天津农业科学;1974年01期
10 兰光燮,王宗明,陆宁,李雷松,周建华,周艳;黔西北地区玉米大斑病菌(Helmithosporium turcicum Pass)生理小种研究[J];西南农业学报;1993年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋庆涛;张国珍;董金皋;;玉米大斑病菌原生质体的制备与再生[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
2 张桂珍;王伟伟;刘金亮;张世宏;张艳华;潘洪玉;;吉林省玉米大斑病菌交配型的检测[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
3 郝志敏;李志勇;董金皋;;玉米大斑病菌磷酯酶C基因(StPLC-1)的克隆与功能分析[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
4 董金皋;张建成;韩建民;赵光耀;;玉米大斑病菌HT-毒素与玉米细胞LOX酶活性的关系[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
5 王茜;王苗苗;郝志敏;董金皋;;不同碳源对玉米大斑病菌PKA-C基因表达规律的影响[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
6 王伟伟;张桂珍;刘金亮;张世宏;赵文生;彭友良;潘洪玉;;玉米大斑病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关基因的克隆[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
7 王伟伟;李桂华;刘金亮;张世宏;张艳华;潘洪玉;;玉米大斑病菌T-DNA插入突变体库的创建及致病相关基因克隆[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
8 曹志艳;温雷蕾;刘士伟;董金皋;;玉米大斑病菌黑色素合成酶基因3hnr的克隆与功能分析[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
9 赵巍;王青;郝志敏;韩建民;董金皋;;玉米大斑病菌PKC基因同源重组载体的构建及启动子序列分析[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
10 刘建光;董金皋;;利用ATMT技术对玉米大斑病菌进行遗传转化及条件的优化[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 通讯员郭鸿涌 记者刘廉君;河北自然科学基金攻关农业病虫害[N];科技日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 申珅;玉米大斑病菌cAMP磷酸二酯酶基因调控病菌发育的功能研究[D];河北农业大学;2013年
2 曹志艳;玉米大斑病菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析[D];河北农业大学;2009年
3 李志勇;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
4 郝志敏;玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
5 赵辉;玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)生理分化和遗传多态性研究[D];沈阳农业大学;2009年
6 谷守芹;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的STK基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 姚晓霞;光调控与玉米大斑病菌黑色素合成途径基因的表达关系研究[D];河北农业大学;2010年
2 张桂珍;玉米大斑病菌生理小种鉴定及球毛壳菌对其生防作用研究[D];吉林大学;2012年
3 郝杰;玉米大斑病菌2A型蛋白磷酸酶基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2010年
4 郭丽媛;中国北方玉米产区玉米大斑病菌生理小种监测及遗传多样性分析[D];河北农业大学;2013年
5 申珅;玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2010年
6 高金欣;东北地区玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)生理分化和遗传多态性研究[D];沈阳农业大学;2011年
7 辛媛媛;黄顶菊内生细菌对玉米大斑病菌拮抗机理初探[D];河北农业大学;2012年
8 李青为;玉米大斑病菌黑色素合成酶基因St4HNR功能分析和胞外黑色素研究[D];河北农业大学;2010年
9 赵巍;PKC调控玉米大斑病菌致病性的机理研究[D];河北农业大学;2011年
10 王晶晶;StPP2A-c基因调控玉米大斑病菌致病性的机制研究[D];河北农业大学;2013年
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