收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆

周艳芬  
【摘要】: 活血化瘀中草药具有“通利血脉,促进血行,消散瘀血”等主要作用,现代药理学研究也证明了活血化瘀中草药可以改善血液的血流动力学、血液流变学和微循环。目前已经从多种生物体内分离出来了能有效治疗血栓性疾病的纤溶酶,多属于丝氨酸蛋白酶类。本文的研究目的是筛选出具有纤溶酶活性的中草药品种,并对其进行分离和性质鉴定。 首先选取瓜萎等42种在临床上具有活血化瘀作用的中草药,水浸提物经硫酸铵沉淀得到蛋白质提取物,利用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性,筛选具有纤溶酶活性的中草药品种。结果表明,瓜蒌、稀莶草、望江南、延胡索、益母草、竹节三七、牛膝、泽泻的蛋白质提取物具有明显的体外纤溶酶活性。 将其中的牛膝、稀莶草水浸提物通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析分离,得到的牛膝40%-4、稀莶草60%-1、稀莶草60%-2、稀莶草60%-3和稀莶草80%-2组分具有较高的纤溶酶比活力。 利用蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物进行处理,结果表明,苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苯甲脒能完全抑制益母草纤溶酶活性,EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用。认为益母草纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。 利用苯甲脒为配基、环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体,制备亲和层析分离介质。对益母草纤溶酶提取物进行亲和层析分离,得到具有纤溶酶活性、表观分子量分别为60 kD和33 kD的蛋白质组分。 纤维蛋白平板、Fibrin-PAGE检测,新鲜瓜蒌蛋白提取物及瓜蒌蛋白提取物均具有纤溶酶活性。蛋白酶抑制剂实验表明,PMSF、大豆胰蛋白酶抑制剂可以完全抑制瓜蒌纤溶酶的活性,苯甲脒、鸡卵类粘蛋白有一定的抑制作用,说明瓜蒌纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。用不同的蛋白质作为作用底物,发现瓜蒌纤溶酶提取物能够有效降解纤维蛋白原和纤维蛋白,而对牛血清白蛋白、牛血红蛋白、人免疫球蛋白基本无降解作用,表明该纤溶酶提取物毒副作用小。激活活性实验表明,瓜蒌纤溶酶的纤溶酶原激活活性明显高于其直接溶纤的活性,属于纤溶酶原激活剂。利用人工合成底物BAEE测定瓜蒌纤溶酶提取物,表明该物质具有胰蛋白酶活性,分析认为瓜蒌纤溶酶是将纤溶酶原中Arg_(557)-Ile_(558)键断裂,产生了纤溶酶。 由于大豆胰蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶的活性完全抑制,因此选用大豆胰蛋白酶抑制剂为配基,以环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体制备亲和层析介质,利用亲和层析对新鲜瓜蒌蛋白提取物进行了分离。得到了两个具有活性的、表观分子量分别为67 kD和55 kD的蛋白酶组分。 瓜蒌纤溶酶提取物经DEAE-Sepharose和CM-Sepharose离子交换,分离出了表观分子量为62.5 kD的蛋白质组分(TkP-Ⅰ),其比活力为109.81 U/mg,样品纯化了3.58倍。 利用植物丝氨酸蛋白酶N-末端序列,以及通过对植物丝氨酸蛋白酶的同源蛋白多重序列的比对,利用保守序列的氨基酸设计兼并引物,采用RT-PCR方法,扩增得到瓜蒌部分基因序列。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 刘琼;;Orbal氧化沟中高效降解菌的分离与筛选[J];安徽农业科学;2011年16期
2 李柠;韦家槐;施万球;;筛选抗病毒中草药的研究 Ⅰ微量细胞培养法和小瓶细胞培养法筛选抗病毒中草药[J];中兽医医药杂志;1988年03期
3 刘莉莉;路福平;刘浩;周闯;;拮抗水霉菌株的筛选及抑菌蛋白的分离纯化[J];天津科技大学学报;2011年04期
4 王颖;杨军;;中草药研究中应注意的几个问题[J];牡丹江师范学院学报(自然科学版);2003年01期
5 李树文;陆秀华;尚海利;;碱性蛋白酶产生菌的筛选[J];莱阳农学院学报(自然科学版);2006年01期
6 朱迎春;马玲;;几种乳酸菌的比较与筛选[J];农产品加工;2008年09期
7 张忠明;;高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究[J];甘肃农业大学学报;2006年01期
8 王琛;马荣山;路振华;;红曲色素高产菌株的筛选[J];辽宁农业科学;2006年06期
9 余登印;;中草药防治中蜂囊状幼虫病[J];中国蜂业;1980年05期
10 王桂香;;四季中药调理灌 牲畜无病壮又欢[J];农业科技与信息;2006年04期
11 高宏伟;张萍;石彦鹏;马继花;;紫外-氯化锂复合诱变选育泰妙菌素高产菌株[J];中国兽药杂志;2011年03期
12 ;草药提炼猪场污水净化剂[J];北方牧业;2005年16期
13 李清飞;郭桥燕;李红丽;王岩;刘国顺;;烟草黑胫病拮抗菌的筛选及其抑制作用研究[J];河南农业科学;2006年03期
14 马荣棣;王振龙;杨玲;柴家前;师吉华;周嗣泉; 王兰明;;“鱼健宝”、中药配方的筛选及防治草鱼“三病”的试验[J];齐鲁渔业;2006年11期
15 邓祥元;周婕;王淑军;李富超;秦松;;高抗根结线虫病海洋链霉菌的初步筛选[J];中国生物防治;2007年01期
16 孙继民;魏宝阳;孙佳为;高国赋;;蜜环菌的提纯复壮与诱变育种[J];湖南农业科学;2008年04期
17 高蓬明;;冬凌草内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[J];安徽农业科学;2008年29期
18 韩立荣;孙平平;张宁;冯俊涛;张兴;;油菜菌核病生防放线菌的分离与筛选[J];安徽农业科学;2011年05期
19 黄杰;林生;林文雄;;芒萁内生纤维素降解菌的筛选[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年15期
20 陈文霞;马慧宁;肖林清;苗君;张莉;;棉花黄萎病菌拮抗细菌的分离、筛选及鉴定[J];西北农业学报;2008年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王岩;肖崇刚;陈国康;窦彦霞;易龙;;烟草根围土壤拮抗放线菌的分离筛选[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
2 梁英;韩鲁佳;;黄芩中黄芩甙和黄芩素提取、分离纯化的研究进展[A];中国农业工程学会第七次会员代表大会论文集[C];2004年
3 谭汝成;卢晓莉;曾令彬;熊善柏;;鱼鲊发酵用乳酸菌的筛选及其发酵特性[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年
4 周葵;赵强;;中草药治疗带状疱疹[A];西黄丸临床应用研究论文集[C];2009年
5 姚守拙;陈波;;中草药研究有关进展[A];第九届全国稀土分析化学学术报告会论文集[C];2001年
6 唐毓勇;黄淑娟;邓汝伊;;百色气温日际变化显著异常的定量分析[A];2008年滇黔桂三省区七州市气象协作区交流会特刊[C];2008年
7 张瑞贤;;方便实用的中药普及读本——评《袖珍中草药彩色图谱》[A];2000中药研究论文集[C];2001年
8 朱杰;;中草药外敷治疗四肢骨折临床总结[A];中华中医药学会学术年会——创新优秀论文集[C];2002年
9 郑东;;祖传秘方中草药及手法整复治疗肱骨髁上骨折30例[A];中华中医药学会骨伤分会第四届第二次会议论文汇编[C];2007年
10 吴清;张永强;杜守颖;;止痛贴膏处方中渗透促进剂的筛选[A];中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周艳芬;瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆[D];河北农业大学;2007年
2 陆志科;竹叶生物活性成分提取分离及其抗菌活性研究[D];中南林学院;2004年
3 徐金瑞;黑大豆种皮花色苷抗动脉粥样硬化及其抗氧化机制研究[D];西北农林科技大学;2006年
4 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
5 马春玲;海洋酵母普鲁兰类酵母碱性蛋白酶发酵生产、特性研究及基因克隆[D];中国海洋大学;2007年
6 陈杰;高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究[D];浙江大学;2008年
7 华颖;纤维蛋白溶解酶的发酵制备、分离纯化及酶学性质研究[D];江南大学;2008年
8 赵萍;家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究[D];西南大学;2008年
9 王元凤;茶多糖的分离纯化、结构及构效关系研究[D];江南大学;2005年
10 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 金香;几丁质降解菌的筛选、鉴定及酶学特性的研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
2 董桂清;产葡甘聚糖酶菌株的筛选及酶的分离纯化[D];广西大学;2007年
3 朱振;产纤维素酶真菌的筛选、发酵条件优化及酶学性质的研究[D];安徽农业大学;2009年
4 俞志明;抗肿瘤植物的筛选及其有效成分的分离纯化[D];浙江工业大学;2005年
5 王影;黄灰青霉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质的研究[D];吉林农业大学;2008年
6 张蕊;产纤溶酶菌株6-1的分离鉴定、发酵优化、纤溶酶的分离纯化及酶学性质研究[D];河北农业大学;2010年
7 魏江洲;海螵蛸多糖的分离纯化及生物学活性研究[D];第二军医大学;2006年
8 隋聪颖;产脂肪酶木霉的分离筛选鉴定及酶学性质研究[D];东北农业大学;2008年
9 李定刚;紫花地丁对奶牛乳房炎病原菌的抗菌活性成分研究[D];西北农林科技大学;2006年
10 李尧;瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)纤溶酶的分离纯化与性质分析[D];河北大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王玉堂;中草药开始用于饲养业[N];中国畜牧报;2004年
2 李巍;中草药与生物技术展吸引大量市民参观[N];河北日报;2007年
3 王道毅 邹文俊;我国中草药出口欧盟的新机遇[N];中国医药报;2006年
4 高素英;中草药牙膏面临政策利好[N];中国经营报;2006年
5 小杨;自种自采自用中草药有了规范[N];中国中医药报;2006年
6 刘士敬;哪些中草药会伤肝[N];农村医药报(汉);2007年
7 蓝蔚林小勇 翁旭欧;就地取材开发中草药[N];温州日报;2008年
8 ;会伤眼的中草药[N];上海中医药报;2008年
9 新 信;中草药会不会降价[N];中国中医药报;2002年
10 本报特约记者 吴志;香烟穿中草药“马甲”同样有害[N];保健时报;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978