收藏本站
《河北农业大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆

周艳芬  
【摘要】: 活血化瘀中草药具有“通利血脉,促进血行,消散瘀血”等主要作用,现代药理学研究也证明了活血化瘀中草药可以改善血液的血流动力学、血液流变学和微循环。目前已经从多种生物体内分离出来了能有效治疗血栓性疾病的纤溶酶,多属于丝氨酸蛋白酶类。本文的研究目的是筛选出具有纤溶酶活性的中草药品种,并对其进行分离和性质鉴定。 首先选取瓜萎等42种在临床上具有活血化瘀作用的中草药,水浸提物经硫酸铵沉淀得到蛋白质提取物,利用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性,筛选具有纤溶酶活性的中草药品种。结果表明,瓜蒌、稀莶草、望江南、延胡索、益母草、竹节三七、牛膝、泽泻的蛋白质提取物具有明显的体外纤溶酶活性。 将其中的牛膝、稀莶草水浸提物通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析分离,得到的牛膝40%-4、稀莶草60%-1、稀莶草60%-2、稀莶草60%-3和稀莶草80%-2组分具有较高的纤溶酶比活力。 利用蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物进行处理,结果表明,苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苯甲脒能完全抑制益母草纤溶酶活性,EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用。认为益母草纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。 利用苯甲脒为配基、环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体,制备亲和层析分离介质。对益母草纤溶酶提取物进行亲和层析分离,得到具有纤溶酶活性、表观分子量分别为60 kD和33 kD的蛋白质组分。 纤维蛋白平板、Fibrin-PAGE检测,新鲜瓜蒌蛋白提取物及瓜蒌蛋白提取物均具有纤溶酶活性。蛋白酶抑制剂实验表明,PMSF、大豆胰蛋白酶抑制剂可以完全抑制瓜蒌纤溶酶的活性,苯甲脒、鸡卵类粘蛋白有一定的抑制作用,说明瓜蒌纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。用不同的蛋白质作为作用底物,发现瓜蒌纤溶酶提取物能够有效降解纤维蛋白原和纤维蛋白,而对牛血清白蛋白、牛血红蛋白、人免疫球蛋白基本无降解作用,表明该纤溶酶提取物毒副作用小。激活活性实验表明,瓜蒌纤溶酶的纤溶酶原激活活性明显高于其直接溶纤的活性,属于纤溶酶原激活剂。利用人工合成底物BAEE测定瓜蒌纤溶酶提取物,表明该物质具有胰蛋白酶活性,分析认为瓜蒌纤溶酶是将纤溶酶原中Arg_(557)-Ile_(558)键断裂,产生了纤溶酶。 由于大豆胰蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶的活性完全抑制,因此选用大豆胰蛋白酶抑制剂为配基,以环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体制备亲和层析介质,利用亲和层析对新鲜瓜蒌蛋白提取物进行了分离。得到了两个具有活性的、表观分子量分别为67 kD和55 kD的蛋白酶组分。 瓜蒌纤溶酶提取物经DEAE-Sepharose和CM-Sepharose离子交换,分离出了表观分子量为62.5 kD的蛋白质组分(TkP-Ⅰ),其比活力为109.81 U/mg,样品纯化了3.58倍。 利用植物丝氨酸蛋白酶N-末端序列,以及通过对植物丝氨酸蛋白酶的同源蛋白多重序列的比对,利用保守序列的氨基酸设计兼并引物,采用RT-PCR方法,扩增得到瓜蒌部分基因序列。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S567

手机知网App
【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 汤祝华;朱春节;张宇;莫颜瑛;谢秀祯;;白色链霉菌(Streptomyces albus)HS1产豆豉纤溶酶发酵条件优化[J];海南师范大学学报(自然科学版);2010年03期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郑延斌,路福平,杜连祥;中国根霉12~#纤溶酶活力单位的测定[J];氨基酸和生物资源;2000年01期
2 韩勃,李红云,张社华;冠心病病人血浆PAI-1活性的变化[J];青岛大学医学院学报;2000年02期
3 迟玉杰,于国平,张永忠,孙艳梅,高学军,郝艳红;蚯蚓纤溶酶的分离纯化[J];东北农业大学学报;1999年03期
4 甄宇红,杨青,张宝;环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶及其动力学分析[J];大连医科大学学报;2005年04期
5 高富红,孙健,吴国娟;天花粉蛋白抗肿瘤作用机理研究概况[J];动物医学进展;2005年11期
6 王淑敏,赵学良,王本祥,周秋丽,刘忠英,安汝国,刘志强,刘淑莹;中药土鳖虫溶栓成分的分离纯化研究[J];分析化学;2005年10期
7 肖静,刘晓兰,杜连祥,凌洪博,许爱清;中国根霉产纤溶酶相对分子质量的测定[J];高师理科学刊;2003年03期
8 贝伟剑;;瓜蒌薤白汤药理研究概况[J];广西中医药;1986年03期
9 周艳芬,赵晓瑜,李亚东,乔环宇;两种染色方法对聚丙烯酰胺凝胶电泳回收蛋白的影响[J];河北大学学报(自然科学版);2003年01期
10 周艳芬;赵晓瑜;张玉;冯书亮;王容燕;;透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达[J];河北大学学报(自然科学版);2006年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋振巧,王洪刚,王建华;栝楼的研究进展[J];山东农业科学;2005年05期
2 孙玉军,陈彦,王洵,李燕斐;蜜环菌胞外多糖的分离纯化及其性质研究[J];安徽大学学报(自然科学版);2005年05期
3 潘婕;高振珅;;红曲霉提取姜黄素影响因子的设定研究[J];安徽化工;2012年02期
4 叶生梅;;稻草秸秆预处理实验研究[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2008年04期
5 程仁云;某县级医院2002-2004年抗感染药物用药分析[J];中医药临床杂志;2005年05期
6 彭耀;;常见中药材掺伪现象和鉴别方法[J];中医药临床杂志;2006年03期
7 钟淮滨;童成亮;;毛细管气相色谱法测定少林风湿跌打膏中3组分的含量[J];中医药临床杂志;2006年05期
8 郭法杰;;瓜蒌属药用植物研究概述[J];中医药临床杂志;2007年04期
9 颜世东;;止癫口服液质量标准的研究[J];中医药临床杂志;2007年06期
10 吴冰;王成永;;木瓜中鞣质的含量测定[J];中医药临床杂志;2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 赖岳晓;刘佩沂;田素英;;正交试验优选肠腹宁颗粒中白头翁皂苷B_4的提取工艺[A];共铸医药学术新文明——2012年广东省药师周大会论文集[C];2012年
2 朱勤勋;严雪;韩友斌;;鼠源IgG抗体F(ab')2片段及Fab片段的制备纯化及其免疫活性研究[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
3 李佑生;黎帅;;活血化瘀药防治血栓病机制研究进展及述评[A];第五次全国中医药防治血栓病学术交流会暨中华中医药学会血栓病分会换届改选工作会议论文集[C];2011年
4 马天良;谢幸珠;张覃华;孙祥明;;苏云金杆菌发酵动力学研究[A];杀虫微生物[C];1992年
5 王宏俊;安烨;龚玉梅;陈小玲;张培君;;Modesto株副鸡禽杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
6 孙晴;;参元丹在治疗冠心病心绞痛方面的络病理论初探[A];北京中医药学会络病专业委员会2010学术年会青年论坛暨急性冠脉综合征(ACS)规范化治疗与中西医结合治疗进展培训班学术论文集[C];2010年
7 季红;吴正钧;陆孝义;;纤溶酶研究进展及以此为借鉴的乳源抗凝肽研究展望[A];中国奶业协会年会论文集2008(下册)[C];2008年
8 陈光亮;孙聪;李莉;;中药防治动脉粥样硬化机制研究进展[A];中医药理论与应用研究——安徽中医药继承与创新博士科技论坛论文集[C];2008年
9 刘彩琴;阮晖;傅明亮;周兵;陈启和;何国庆;;α-半乳糖苷酶的液体发酵条件和酶学性质研究[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
10 张海龙;田兆丰;董志;张晏如;张飞云;;多花黑麦草斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达[A];2010植物免疫机制研究及其调控研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 张少平;豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究[D];华南理工大学;2010年
3 宗惠;活血补肾法调控慢性盆腔炎大鼠炎症细胞因子及粘连相关指标的实验研究[D];山东中医药大学;2010年
4 颜日明;聚球藻7942光自养本征生长动力学及其能量利用研究[D];华东理工大学;2011年
5 冯玉红;微生物纤维素及其氧化衍生物的合成与性能研究[D];昆明理工大学;2008年
6 王翠翠;文蛤多肽的分离纯化及抗肿瘤机制研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
7 周波;枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D];山东农业大学;2011年
8 赵梓纲;白念珠菌磷脂酶B的原核表达、纯化及功能验证[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
9 马腾文;8-烷基巴马汀同系物的合成与药理活性评价[D];西南大学;2011年
10 郜峦;基于文献分析的“肺与大肠相表里”证治规律及其关系研究[D];北京中医药大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李浩丽;Bacillus pumilus CN8菌株高效降解猪血Hb酶的分离纯化与降解机制探讨[D];华中农业大学;2010年
2 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
3 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
4 张献芳;利用半夏凝集素构建内生工程菌及其抗同翅目害虫效果研究[D];华中农业大学;2010年
5 侯玮玮;纳他霉素产生菌的发酵工艺优化[D];华中农业大学;2010年
6 吴婕;多拉菌素产生菌的诱变育种及培养条件的优化[D];华中农业大学;2010年
7 陈龚莉;不同居群栝楼分子遗传多样性及生物碱分析[D];华中农业大学;2010年
8 杜学敏;蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质[D];河北大学;2007年
9 潘海波;利用DNA体外重组技术构建高活性纤维素酶基因工程菌[D];安徽工程大学;2010年
10 季爱云;聚β-羟基丁酸酯高产菌株的选育及发酵和提取工艺研究[D];山东科技大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 陶琳,孟凡涛,吴思方;豆豉溶栓酶的研究进展[J];氨基酸和生物资源;2005年01期
2 叶秀芳;陈忻;陈纯馨;曾东辉;黄汉文;;佛山禅城市场豆芽中有害成分的检测[J];佛山科学技术学院学报(自然科学版);2008年01期
3 章海锋;朱建良;傅明亮;陈启和;;微生物发酵生产纤溶酶研究进展[J];粮油加工;2008年09期
4 陈则华;李理;;利用大豆黄浆水的发酵研究[J];食品研究与开发;2007年03期
5 罗明典;微生物制药研究新进展[J];微生物学通报;1998年01期
6 ;Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2[J];Agricultural Sciences in China;2009年05期
7 韩立德,盖钧镒,张文明;大豆营养成分研究现状[J];种子;2003年05期
8 姚晓玲;宋卫江;吴思方;;豆豉溶栓酶液态发酵工艺研究[J];中国酿造;2007年04期
9 郑丽娜;赵莹;;绿豆发芽过程中营养成分的变化[J];中国农学通报;2008年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 齐海萍;豆豉纤溶酶的制备、酶学特性及功能性质研究[D];江南大学;2004年
2 范晓丹;新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D];华南理工大学;2006年
【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 杨菁;枯草芽孢杆菌LD-8547溶栓酶溶栓效果初步研究[D];福建农林大学;2011年
2 刘彩平;产纤溶酶菌DC-YJ11的筛选鉴定、混合发酵优化及纤溶酶的分离纯化[D];华南理工大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 路福平,王敏,王建玲,杜冰,杜连祥,李颖;血栓溶解酶产生菌及其培养条件的研究[J];氨基酸和生物资源;1997年02期
2 江漫涛,陈滴;分蘖葱头和长梗薤白的研究(一) 有效成份[J];白求恩医科大学学报;1984年05期
3 江漫涛,杨晓虹,陈光荣,陈滴,谷月卿;分蘖葱头和长梗薤白的研究(二) 抑制血小板聚集和阻断血栓素A_2合成[J];白求恩医科大学学报;1984年06期
4 程熠,史方亮,王之光,洪敏;溶栓素的纯化研究[J];白求恩医科大学学报;2001年01期
5 张立,史方亮,洪敏;亲和层析法纯化溶栓素[J];吉林大学学报(医学版);2003年01期
6 周广宇,毕黎琦,高申,郑德明;天花粉蛋白对淋巴细胞亚群的免疫调节作用[J];吉林大学学报(医学版);2003年03期
7 汪东风,李俊,王常红,赵贵文,金涌,陈玎玎,叶盛;茶叶多糖的组成及免疫活性研究[J];茶叶科学;2000年01期
8 龙云铸,范学工,李宁,黄宇琨;应用双向电泳对HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组的初步研究[J];中国医师杂志;2003年06期
9 叶智彰,于力,涂光俦,冉永禄,阮长耿,陈重坤,程大卫,严菊英,陈悦书;浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒纤溶组份对凝血系统的作用[J];动物学研究;1981年01期
10 高秀华;水蛭素的临床应用[J];国外医药(合成药 生化药 制剂分册);2001年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘琼;;Orbal氧化沟中高效降解菌的分离与筛选[J];安徽农业科学;2011年16期
2 李柠;韦家槐;施万球;;筛选抗病毒中草药的研究 Ⅰ微量细胞培养法和小瓶细胞培养法筛选抗病毒中草药[J];中兽医医药杂志;1988年03期
3 刘莉莉;路福平;刘浩;周闯;;拮抗水霉菌株的筛选及抑菌蛋白的分离纯化[J];天津科技大学学报;2011年04期
4 王颖;杨军;;中草药研究中应注意的几个问题[J];牡丹江师范学院学报(自然科学版);2003年01期
5 李树文;陆秀华;尚海利;;碱性蛋白酶产生菌的筛选[J];莱阳农学院学报(自然科学版);2006年01期
6 朱迎春;马玲;;几种乳酸菌的比较与筛选[J];农产品加工;2008年09期
7 张忠明;;高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究[J];甘肃农业大学学报;2006年01期
8 王琛;马荣山;路振华;;红曲色素高产菌株的筛选[J];辽宁农业科学;2006年06期
9 余登印;;中草药防治中蜂囊状幼虫病[J];中国蜂业;1980年05期
10 王桂香;;四季中药调理灌 牲畜无病壮又欢[J];农业科技与信息;2006年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王岩;肖崇刚;陈国康;窦彦霞;易龙;;烟草根围土壤拮抗放线菌的分离筛选[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
2 梁英;韩鲁佳;;黄芩中黄芩甙和黄芩素提取、分离纯化的研究进展[A];中国农业工程学会第七次会员代表大会论文集[C];2004年
3 谭汝成;卢晓莉;曾令彬;熊善柏;;鱼鲊发酵用乳酸菌的筛选及其发酵特性[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年
4 周葵;赵强;;中草药治疗带状疱疹[A];西黄丸临床应用研究论文集[C];2009年
5 姚守拙;陈波;;中草药研究有关进展[A];第九届全国稀土分析化学学术报告会论文集[C];2001年
6 唐毓勇;黄淑娟;邓汝伊;;百色气温日际变化显著异常的定量分析[A];2008年滇黔桂三省区七州市气象协作区交流会特刊[C];2008年
7 张瑞贤;;方便实用的中药普及读本——评《袖珍中草药彩色图谱》[A];2000中药研究论文集[C];2001年
8 朱杰;;中草药外敷治疗四肢骨折临床总结[A];中华中医药学会学术年会——创新优秀论文集[C];2002年
9 郑东;;祖传秘方中草药及手法整复治疗肱骨髁上骨折30例[A];中华中医药学会骨伤分会第四届第二次会议论文汇编[C];2007年
10 吴清;张永强;杜守颖;;止痛贴膏处方中渗透促进剂的筛选[A];中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王玉堂;中草药开始用于饲养业[N];中国畜牧报;2004年
2 李巍;中草药与生物技术展吸引大量市民参观[N];河北日报;2007年
3 王道毅 邹文俊;我国中草药出口欧盟的新机遇[N];中国医药报;2006年
4 高素英;中草药牙膏面临政策利好[N];中国经营报;2006年
5 小杨;自种自采自用中草药有了规范[N];中国中医药报;2006年
6 刘士敬;哪些中草药会伤肝[N];农村医药报(汉);2007年
7 蓝蔚林小勇 翁旭欧;就地取材开发中草药[N];温州日报;2008年
8 ;会伤眼的中草药[N];上海中医药报;2008年
9 新 信;中草药会不会降价[N];中国中医药报;2002年
10 本报特约记者 吴志;香烟穿中草药“马甲”同样有害[N];保健时报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周艳芬;瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆[D];河北农业大学;2007年
2 陆志科;竹叶生物活性成分提取分离及其抗菌活性研究[D];中南林学院;2004年
3 徐金瑞;黑大豆种皮花色苷抗动脉粥样硬化及其抗氧化机制研究[D];西北农林科技大学;2006年
4 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
5 马春玲;海洋酵母普鲁兰类酵母碱性蛋白酶发酵生产、特性研究及基因克隆[D];中国海洋大学;2007年
6 陈杰;高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究[D];浙江大学;2008年
7 华颖;纤维蛋白溶解酶的发酵制备、分离纯化及酶学性质研究[D];江南大学;2008年
8 赵萍;家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究[D];西南大学;2008年
9 王元凤;茶多糖的分离纯化、结构及构效关系研究[D];江南大学;2005年
10 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 金香;几丁质降解菌的筛选、鉴定及酶学特性的研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
2 董桂清;产葡甘聚糖酶菌株的筛选及酶的分离纯化[D];广西大学;2007年
3 朱振;产纤维素酶真菌的筛选、发酵条件优化及酶学性质的研究[D];安徽农业大学;2009年
4 俞志明;抗肿瘤植物的筛选及其有效成分的分离纯化[D];浙江工业大学;2005年
5 王影;黄灰青霉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质的研究[D];吉林农业大学;2008年
6 张蕊;产纤溶酶菌株6-1的分离鉴定、发酵优化、纤溶酶的分离纯化及酶学性质研究[D];河北农业大学;2010年
7 魏江洲;海螵蛸多糖的分离纯化及生物学活性研究[D];第二军医大学;2006年
8 隋聪颖;产脂肪酶木霉的分离筛选鉴定及酶学性质研究[D];东北农业大学;2008年
9 李定刚;紫花地丁对奶牛乳房炎病原菌的抗菌活性成分研究[D];西北农林科技大学;2006年
10 李尧;瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)纤溶酶的分离纯化与性质分析[D];河北大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026