杨树多基因遗传转化及外源基因表达研究

【摘要】： 以转抗虫基因741杨为受体，进一步转化了发根农杆菌Ri质粒T—DNA，获得了转多基因741杨株系，通过转多基因植株生根特性、形态变异、叶片Bt毒蛋白含量、激素含量及抗虫性分析，初步筛选出了抗虫易扦插转基因741杨株系；探讨了外源基因(BtCrylAc基因和Ri质粒T—DNA)在转多基因植株中表达的相互影响及环境胁迫对外源基因表达的影响。在此基础上，将由Ri质粒上克隆出的rolB、rolC基因分别转入了普通741杨，用于研究rolC和rolB基因的功能及在转基因植物中的表现，筛选易生根转基因株系。主要研究结果如下： 1．以具高抗虫性的转抗虫基因741杨株系pb29及多基因转化的741杨(抗虫基因和Ri质粒T—DNA)株系田间苗为材料，研究了转多基因741杨田间的生长特性，观察741杨叶片形状大小、叶片重、叶柄长短。结果表明，转多基因741杨和未转发根农杆菌的植株叶片相比，叶片形状变的短而宽，但单位重量变化不大，4种内源激素含量均增加2倍以上。 2．采用ELISA技术，对转多基因741杨田间植株叶片上的Bt毒蛋白进行测定，并在室温下做了饲虫试验。结果表明，转多基因741杨叶片上Bt毒蛋白含量均小于未转发根农杆菌的双抗虫741杨(Pb29)；死亡率和pb29相比，多基因741杨对杨扇舟蛾的致死率降低，但对幼虫的生长发育仍有明显的滞育作用，影响了杨扇舟蛾生命周期正常的完成，对美国白蛾的致死率仍是100％，这说明外源基因发根农杆菌Ri质粒T-DNA的转入，抑制了Bt基因的表达。 3．以转抗虫基因741杨株系pb29及多基因转化的741杨株系组培苗为材料，在NaCl胁迫环境下，研究了不同转基因株系对NaCl胁迫的反应。结果表明，转入Ri质粒T-DNA上的rol基因后，导致苗木根系数量增加，根系长度减小，IAA和GA激素含量显著提高，抗虫BtCrylAc基因的毒蛋白表达量降低；随着NaCl胁迫强度的增加，苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低，而根系的长度提高，Bt毒蛋白表达显著提高，这说明随着环境条件的改变，转基因杨外源基因的表达发生了改变。 4．以741杨为受体，利用农杆菌介导法分别转化了rolB、rolC基因，得到转rolB基因的无性系15个，转rolC基因的无性系2个，通过PCR技术，分别检测了rolB、rolC基因和NptⅡ基因，初步证明，rolB、rolC基因已成功整合到741杨基因组中。