水稻新型CBF转录因子基因OsCBF1的克隆、表达和表达载体构建

【摘要】： 在我国北方地区，低温、盐分和干旱等非生物逆境在作物生长期间普遍发生。提高作物对上述逆境的抵御能力，对我国北方地区作物生产水平的提高具有重要意义。研究表明，在低温、盐分和干旱等逆境条件下，通过逆境信号在植物体内转导以及应答和抵御基因的有序表达，植物本身通常对上述逆境产生迅速应答和一定程度的抵御能力。其中，CBF类转录因子在增强植物抵御上述逆境的能力中具有重要作用。 本项研究在克隆新型水稻CBF类转录因子基因(OsCBF1)的基础上，较全面阐明了OsCBF1的表达调控特性，构建了分别融合OsCBF1编码阅读框和启动子区的植物双元表达载体，为进一步揭示该基因的功能和表达调控特征奠定了理论基础。 主要结果如下： 1、在国际生物信息学网站NCBI进行BLAST分析，发现了尚未进行特征分析和功能报道的推定CBF转录因子的基因(GenBank登陆号：NP_910360)。本研究将其命名为OsCBF1。以台北309水稻品种的DNA为模板，扩增出该基因全长。 2、OsCBF1全长772 bp，其中开放阅读框(ORF)为645 bp，5′与3′端的非编码区分别为27 bp和100 bp。在基因组水平上，OsCBF1不含有内含子。OsCBF1编码214个氨基酸残基，分子量为23.5 KD。含有转录因子共有的核定位信号区、DNA结合区和转录调控区。 3、在正常、低温、盐分和干旱处理中，对OsCBF1及其同源的8个未研究报道的水稻CBF基因的表达进行了研究。其中检测到OsCBF1、CBF1-like、RCBF3、unname1和unname6的转录本，其它基因的转录本未能被检测到。后者的转录本未能被检测可能是由于上述基因在试验条件下不表达，或表达丰度低于本研究检测范围以及引物设计有待进一步优化有关。 4、OsCBF1的表达在正常生长(CK)和低温处理下表现为根特异性。CBF1-like、unnamed1和unnamed6在根中的表达表现为低温诱导特性，其中，CBF1-like和unnamed6表现为诱导增强特性，低温处理2 h后，转录本数量较对照显著增多，以后至4 h较2 h时有所降低(CBF1-like)或继续增大(unnamed6)，但均高于CK；unnamed1的表达表现为低温诱导特征，且随着低温处理时间的延长，转录本的数量迅速增多。表明，OsCBF1、unnanmed1和unnamed6等CBF转录因子在介导水稻的低温信号转导中可能具有较重要作用。 5、在盐分胁迫3 h后，OsCBF1、CBF1-like、RCBF3和unnamed6根中的转录本均较对照增多，其中，以OsCBF1和unnamed6转录本的增加幅度较大，表明上述基因可能参与了盐分逆境信号在根中的转导。上述基因在叶中的表达与根中有所不同，其中，OsCBF1在对照和各盐分处理下均不表达，CBF1-like表现为盐分诱导特性，RCBF3受到盐分调控的效应较小。而unnamed6呈下调表达趋势。表明不同CBF基因在植株不同器官中介导盐分逆境信号的能力和机制存在差异。 6、干旱胁迫后3 h对根中OsCBF1、CBF1-like、RCBF3、unnamed1和unnamed6的表达水平没有影响；干旱处理对OsCBF1、CBF1-like和unnamed1在叶中表达的影响也较小，但使RCBF3和unnamed6的表达水平明显降低。表明RCBF3和unnamed6基因可能以负向调节的方式参与了叶中的干旱信号转导过程。 7、采用DNA重组技术，构建了将OsCBF1编码阅读框(ORF)正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-OsCBF1。并将此双元表达载体转化农杆菌LBA4404后获得阳性克隆。为进一步转化植株，鉴定OsCBF1的功能奠定了基础。 8、用水稻TP309 DNA为模板，根据OsCBF15'侧翼启动子区序列扩增了OsCBF1的启动子。分析发现，该启动子含有多个参与调控下游基因的调控元件。采用分子克隆技术，构建了将OsCBF1启动子正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-OsCBF1P。为下一步鉴定OsCBF1启动子的功能和该基因的调控元件提供了依据。

【关键词】：水稻 非生物胁迫 转录因子 OsCBF1 编码蛋白特征 基因表达 表达载体构建
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S511
【目录】：