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《河北农业大学》 2008年
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调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析

李志勇  
【摘要】: 玉米大斑病的控制始终是玉米生产上的一个重要问题,而控制玉米大斑病危害的一个重要前提是要了解其致病过程。玉米大斑病菌的致病过程是玉米大斑病菌和寄主玉米相互识别、相互作用的过程,研究这一特异互作过程中的信号转导机制对深入了解玉米大斑病菌的致病机理,设计新型杀菌剂,提出新的植物病害控制策略具有重要意义。本论文主要研究了Ca~(2+)信号转导途径对玉米大斑病菌分生孢子形态构建及致病性的调控作用。 本文首先利用Ca~(2+)信号转导途径特异性抑制剂确定了Ca~(2+)信号转导途径与玉米大斑病菌的孢子萌发、附着胞形成和致病性相关。研究发现,钙调素抑制剂TFP和钙调磷酸酶抑制剂CsA处理分生孢子,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程,抑制剂可使附着胞明显变小甚至不能形成,以上结果表明钙信号传导途径参与了玉米大斑病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。 根据已知植物病原真菌钙调素(CaM)氨基酸序列保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌cDNA为模板,通过PCR技术获得CaM基因的同源片段,利用SMART-RACE技术获得了CaM的cDNA全长序列。并根据CaM基因cDNA全长序列设计基因特异性引物扩增玉米大斑病菌基因组DNA获得了该基因DNA全长。利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析,发现该开放阅读框所编码的氨基酸序列与许多真菌如水稻胡麻斑(Cochliobolus miyabenus)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等的钙调素基因的相似性为95%~100%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调素基因CaM,所获得的cDNA序列已提交GenBank(登录号为EF010936)。玉米大斑病菌CaM基因DNA全长776 bp,cDNA全长450 bp,编码149个氨基酸,有4个内含子,试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。 利用genomic walking技术获得CaM基因启动子序列,用Proscan在线软件对启动子序列进行分析,发现该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、Sp1、AP-2和TFIID)。Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的CaM基因在基因组中以单拷贝形式存在。 为了研究钙调素基因对大斑病菌致病性的调控作用,构建了玉米大斑反义诱导表达载体,并对它们的正确性进行了酶切验证。利用PEG介导的转化系统将构建好的含有潮霉素抗性筛选标记的反义表达载体转化到玉米大斑病菌原生质体中,获得了14个抗性转化子,这些转化子能在潮霉素抗性平皿上连续继代培养。通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物和分子杂交进行筛选,得到了2个CaM基因反义表达突变体。在奎宁酸诱导条件下,玉米大斑病菌CaM基因反义表达突变体分生孢子萌发率降低,分生孢子萌发后形成的附着胞多为畸形并且黑色素沉积减少,提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降。 利用候选基因法克隆了钙调素下游的钙调磷酸酶A亚基、钙调素依赖性蛋白激酶基因。 钙调磷酸酶A亚基编码525个氨基酸,利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析发现,所编码的氨基酸序列与许多真菌如小麦颖枯病菌(P.nodorum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等的钙调磷酸酶基因的相似性为860%~94%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调磷酸酶基因CNA,所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号为(EF407562)。该基因内部含有6个内含子,分别为116bp、47bp、47bp、47bp、47bp和49bp。 玉米大斑病菌中钙调素依赖性的蛋白激酶有4个不同亚型,通过RACE技术已经克隆出3个钙调素依赖性的蛋白激酶基因的全长,而第4个仅得到部分片段。所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号分别为(EU605885,EU605886,EU605887)。4个不同亚型的钙调素依赖性的蛋白激酶都含有蛋白激酶ATP结合位点和活性位点保守基序。 信号转导途径对玉米大斑病菌孢子形态构建及致病性发挥着重要调控作用。抑制剂实验和钙调素基因反义抑制实验均表明钙调素基因对于玉米大斑病菌形成正常附着胞是重要的,同时钙调素也调控着毒素的合成。而玉米大斑病菌钙信号传导途径的重要组分钙调素依赖的磷酸酶、激酶基因的克隆,为后续认识玉米大斑病菌钙信号途径奠定基础。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S435.131

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【引证文献】
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【参考文献】
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10 黄乾明;谢君;杨婉身;;粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析[J];菌物学报;2007年01期
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【共引文献】
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10 杨开静;张琦;卢威;刘建萍;焦绪栋;;大叶胡颓子叶乙酸乙酯部抗菌作用的研究[J];安徽农业科学;2011年14期
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4 王青;韩建民;董金皋;;玉米大斑病菌PKC基因敲除及正、反义表达载体的构建[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
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6 李巧芝;王兵;;洛阳谷子病害发生情况及防控措施[A];河南省植物病害研究进展——河南省植物病理学与现代农业学术讨论会论文集[C];2011年
7 张弘;陈怀亮;徐爱东;刘伟昌;杨海鹰;;河南省小麦条锈病发生发展气象等级预报研究[A];中国气象学会2007年年会生态气象业务建设与农业气象灾害预警分会场论文集[C];2007年
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1 汪航;“柏拉玛地”玉米大斑病无病斑型抗性基因HtNB的定位[D];华中农业大学;2010年
2 王威;玉米瘤黑粉病抗性的遗传特点及生化特性研究[D];甘肃农业大学;2010年
3 吴娇娇;微生物脂肪酶基因的克隆与表达[D];华东理工大学;2011年
4 王白羽;小黑麦耐盐碱相关基因克隆及其功能验证[D];石河子大学;2010年
5 王保明;油茶亲环素、钙调素基因的cDNA克隆及亲环素基因的原核表达[D];中南林业科技大学;2008年
6 崔丽莉;版纳龙竹CONSTANS和LEAFY同源基因的克隆与序列分析[D];西南林业大学;2010年
7 赵巍;PKC调控玉米大斑病菌致病性的机理研究[D];河北农业大学;2011年
8 张立峰;TcLr19与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA文库构建及TaTCTP表达分析[D];河北农业大学;2011年
9 王茜;PKA催化亚基调控玉米大斑病菌致病性的机制研究[D];河北农业大学;2011年
10 王玉凤;小麦叶锈病的生物防治及水杨酸诱导抗病性研究[D];河北农业大学;2011年
【同被引文献】
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1 唐树戈;庄敬华;高增贵;吴海云;陈捷;;玉米弯孢菌毒素培养条件的研究[J];安徽农业科学;2007年01期
2 王晓飞;薛春生;徐书法;刘力行;陈捷;;玉米弯孢菌黑色素性质及其在致病性中的作用研究[J];安徽农业科学;2007年21期
3 赵来顺,臧少先,杨军玉,田学军,董金皋;玉米黄斑病研究──Ⅲ.病原菌Curvularia lunata致病毒素初探[J];河北农业大学学报;1997年02期
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10 冯晶,高增贵,薛春生,庄敬华,陈捷,白淑英;玉米弯孢霉叶斑病菌产生的细胞壁降解酶的致病作用研究[J];杂粮作物;2002年03期
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7 王苗苗;玉米大斑病菌cAMP依赖性蛋白激酶A基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2009年
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3 黄勇娣;世界首例转基因克隆兔在沪诞生[N];解放日报;2007年
4 许沈华;什么是基因克隆[N];家庭医生报;2007年
5 王婷婷;我国完成世界首例转基因克隆兔实验[N];科技日报;2007年
6 曹斌;血癌新病毒基因克隆成功[N];团结报;2000年
7 王有佳;全球首例转基因克隆兔在沪诞生[N];人民日报;2007年
8 李建平;首例荧光转基因克隆猪所产猪崽再次被确认具有荧光特征[N];大众科技报;2008年
9 记者 王中宙;25只转基因克隆绵羊在内蒙古农业大学诞生[N];呼和浩特日报(汉);2010年
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3 邢继红;拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2006年
4 魏继承;白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆[D];东北林业大学;2006年
5 赵明莲;食线虫真菌侵染性胞外蛋白酶的基因克隆与表达[D];云南大学;2003年
6 郭虹;弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究[D];中山医科大学;1999年
7 王昕;巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究[D];中国协和医科大学;1998年
8 李伟;圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D];四川农业大学;2006年
9 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
10 倪多娇;栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘艳梅;玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
2 邵伯飞;TaMlo3基因克隆与功能分析[D];浙江大学;2002年
3 鲍鸣;鸡IFN-γ基因的克隆与原核表达[D];安徽农业大学;2005年
4 刘占通;猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D];河南农业大学;2005年
5 张怡;重组鼠抗人CD19单链抗体的构建和表达[D];浙江大学;2006年
6 郝敏;玉米与大斑病菌构成的不同互作中基因表达的研究[D];河北农业大学;2006年
7 黄志强;产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆[D];福建农林大学;2006年
8 武鸿;嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];浙江大学;2007年
9 余国武;腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析[D];西南大学;2007年
10 赵秀振;蓖麻蚕体液胰凝乳蛋白酶抑制剂调查及其基因克隆[D];中国农业科学院;2007年
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