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低剂量辐射对HMW-GS基因转化小麦的影响

苏俊  
【摘要】: 本试验主要有两方面研究内容:1.用剂量为0.5KRad、1.0KRad和1.5Krad的γ射线照射孕穗期的小麦,开花期利用花粉管通道法将HMW-GS 5+10亚基基因导入小麦;2.用剂量为0.5KRad、1.0KRad、2.0KRad和5.0KRad的软γ射线照射小麦幼胚后诱导愈伤组织,恢复培养后用基因枪法导入HMW-GS5+10亚基基因。目的是利用辐射与遗传转化相结合的方法,将优质蛋白亚基HMW-GS5+10基因导入小麦中改良其品质,同时研究低剂量辐射对遗传转化的影响,确定促进小麦遗传转化的活体和幼胚的适宜照射剂量。 主要研究结果如下: 对13个基因型的幼胚进行培养效果研究。结果表明,分化率和培养力均存在基因型差异,而各基因型的出愈率差别不大。农大718、龙麦29和龙麦8培养力较高,是较理想的转化试材。三种外植体(幼胚、幼穗和成熟胚)培养效果表明,幼胚、成熟胚的出愈率基本相同,高于幼穗,且差异达极显著。分化率差异较大,高低趋势为幼胚>幼穗>成熟胚,培养力大小为幼胚>成熟胚>幼穗。可见幼胚是较理想的遗传转化外植体,但选择何种外植体作为试材还应考虑试验条件,取材方便与否等因素。 以龙辐麦8、龙辐819、龙麦29、东大718、K1122和K234品种(系)的幼胚为试材,在三种培养基上(MS、2MS和B_5)进行培养力的研究。6个品种(系)在三个培养基上的诱导率在93.98%~100%之间;在MS培养基上6份材料的平均分化率为26.7%,2MS培养基上为18.3%,而在B_5培养基为1.7%。综合出愈率、分化率情况,对以上6个品种进行幼胚的离体培养,最适宜培养基为MS培养基。软γ射线照射后对愈伤组织增重量有影响,0.5KRad照射的愈伤组织增重量与对照差异不大,且随照射剂量的加大愈伤组织增重量呈递减趋势。龙麦29、龙辐819、农大718和龙辐麦8四个品种的幼胚辐射后接种在诱导培养基上,第14-16天左右出现增重量峰值,随着培养时间的增长愈伤组织重量呈递减趋势,随着剂量增加愈伤组织增重逐渐下降。超微结构观察表明软X射线照射小麦幼胚产生的愈伤组织会产生核膜断裂、质壁分离、线粒体空泡化、液泡数增多变大等现象,且随着照射剂量的增加其变化更明显。从形态和功能上分析辐射能够打破细胞自身防卫封闭系统,有利于外源基因导入。 利用基因枪法将HMW-GS5+10亚基基因导入愈伤组织中,在照射剂量为0.5和1.0 KRad的软γ射线照射幼胚的处理中有4株经PCR和PCR-Southem杂交检测证实该基因已整合到受体基因组中。试验结果证实,转基因植株均为经过低剂量辐射处理得到的,且转化率明显高于对照;对照及其它辐射处理均没有获得转化植株。经SDS-PAGE电泳分析,利用花粉管通道法导入HMW-GS5+10亚基基因的龙辐麦8号和龙辐麦10号中,已在3株小麦中有HMW-GS5+10亚基基因的蛋白表达,经PCR和PCR-Southern杂交证实,目的基因已整合到这3株小麦基因组中。龙辐麦10号转化率为1.95‰;龙辐麦8号转化率为6.51‰。这3株小麦的照射剂量分别是:龙辐麦10号1株,剂量为1.0KRad;龙辐麦8号2株,剂量为0.5KRad。由此可认为,对小麦进行低剂量的辐射处理可提高其遗传转化率。低剂量辐射处理促进遗传转化的适宜剂量大致为:用γ射线照射孕穗期植株剂量为0.5KRad-1.0KRad;用软γ射线照射幼胚为0.5-1.0KRad。 转基因品系除目的基因性状表达外,其它农艺性状也产生变化,主要是由于目的基因整合位点的随机性及基因间互作造成的。对转HMW-GS5+10基因的品系进行品质分析,其沉淀值、稳定时间、延伸性和面积较受体有较大提高。对转HMW-GS5+10基因的转基因品系进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,高分子麦谷蛋白亚基组成均具有5亚基和10亚基,从蛋白质水平证实目的基因的表达。


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