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rol基因对741杨的遗传转化及表达研究

缪丽萍  
【摘要】: Ri质粒上含有诱根基因即rol基因,将含rol基因表达载体导入植物体内均能提高植物的生根能力,而rol基因转入后往往使植株表现出一些变异,对植物的生长发育产生很大的影响。为了研究rol基因对植物造成的变异,本实验通过对遗传转化条件的优化,将rolB、rolC诱根基因导入741杨,对转化植株生长变化、叶绿素含量、荧光特性,以及内源激素含量等生理指标进行检测,并对农杆菌介导法中农杆菌在转化植株上的残存状况进行研究,主要内容及结果如下: 采用含rol基因的植物表达载体感染741杨叶片外植体,优化转化体系,获得转rolB基因苗8个系号,转rolC基因苗18个系号。研究结果表明:741杨叶片在MS培养基附加6-BA 1.0和NAA 0.1时,分化率可提高至97%;筛选培养时Km临界浓度为40 mg/L;附加400 mg/L CTX可有效抑制细菌,并减少抗生素对叶片分化的影响;侵染和共培养时添加AS 150 mg/L,农杆菌侵染9-14 min,共培养3 d时,可将转化效率提升至51%;而预培养时间的延长,不利于转化效率的提高。通过Km筛选和PCR检测,初步确定rol基因已转入目的植株。 对转基因植株发根量、生长变化、叶绿素含量、荧光特性,以及内源激素含量进行检测。结果表明:转rolB基因各株系发根率,发根量提高。多数株系苗高与对照无显著差异,叶绿素a、b、a+b含量上升, Fv/Fm、PI值下降,叶绿素a、b、a+b之间呈极显著正相关性,叶绿素a、b、a+b与PI呈负相关性,激素含量存在较大变化,IAA、ZT含量上升,ABA含量下降,IAA/ABA值上升,这与发根率和发根量的变化是一致的,IAA/ZT值上升,与苗高变化存在一定差异。转rolC基因各株系发根率、生根量提高,顶端优势受到抑制,植株矮化,叶绿素含量降低,叶绿素a、b、a+b之间呈极显著正相关性,叶绿素a、b与PI呈显著正相关性,IAA、ZT、ABA含量上升,IAA/ABA和IAA/ZT值上升,与发根量和苗高的变化一致。 对转Ri质粒741杨在继代和移栽过程中农杆菌残存状况分析。结果表明:经农杆菌介导转化后,将转化植株继代于附加300 mg/L CTX培养基可基本抑制残存农杆菌活性;随着转化植株在含抗生素培养基中继代时间的延长,残存农杆菌的数量和活性逐步下降,在继代18个月后,无法培养出目的菌落,但转化植株一旦脱离抗生素环境,残存农杆菌数量和活性又将得到恢复;农杆菌主要分布于植株体表和茎中。残存农杆菌,严重影响转化植株存活和PCR对植株的检测,并导致外源基因的漂移。


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