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拟南芥AtPLC1、AtPLC6基因参与花粉发育及花粉管极性生长过程的研究

杜娟  
【摘要】: 磷脂酶C(PLC)是肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶,该信号系统在动植物细胞的生长发育及介导胞外信号的跨膜传递中发挥着重要的作用,其作用的分子机制已经成为目前研究的热点。测序工作完成之后,发现拟南芥基因组中有14种不同的PLC和类PLC基因。不同的PLC可能参与不同的生理过程。探讨究竟哪一种或几种PLC亚型基因参与花粉发育和花粉成熟及萌发过程,不仅可以为PLC的功能研究和作用机制的探讨提供重要的依据,还可以为花粉发育过程的研究提供依据。 本研究以两种拟南芥PLC亚型AtPLC1与AtPLC6的突变体为材料,利用反向遗传学的方法,通过遗传转化、RT-PCR等分子生物学及组织化学分析及花粉发育过程观察,进行PLC参与花药发育及花粉萌发过程功能的研究。 主要结果如下: 1.对购自SALK库的拟南芥AtPLC1与AtPLC6两个亚型基因的的T-DNA插入突变体进行筛选和鉴定。通过Kanr平板筛选与PCR、RT-PCR等方法,检测筛选出两个亚型基因的T-DNA插入突变体,一个是AtPLC6基因缺失表达的突变纯合体P6,一个是AtPLC1基因表达降低的突变杂合体P1(推断该基因的缺失表达会造成纯合致死)。另外,我们通过载体构建和遗传转化等工作,分别获得两种基因的超表达植株,分别为P1-1、P1-2和P6-1、P6-2。 2.构建了AtPLC1和AtPLC6两个基因的组织定位转基因表达载体,经GUS染色后观察,结果表明AtPLC1和AtPLC6均为组成型表达基因。AtPLC1的表达量要高于AtPLC6。 3.通过花粉体外萌发试验,发现P6突变体的花粉管的生长出现分叉、弯曲和膨大现象,推测AtPLC6参与了花粉管的极性生长的调节。 4.对不能获得突变纯合体的P1,进一步通过杂交和石蜡切片等技术的检测,发现P1的花粉囊中丢失了带有T-DNA插入的成熟花粉,表明AtPLC1基因参与了花粉发育的生理过程。 另外,还观察了不同的非生物胁迫下,NaCl、聚乙二醇、ABA、葡萄糖和蔗糖胁迫下,种子的萌发率和幼苗的生长状况,发现AtPLC1的超表达体P1-1和P1-2表现明显受到ABA的抑制。在葡萄糖和蔗糖胁迫下P1-1、P1-2的萌发率均高于Col,推测可能是AtPLC1基因参与了植物的渗透作用。


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