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《河北农业大学》 2009年
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玉米大斑病菌STK1基因对附着胞发育和渗透胁迫的调控及其细胞学定位载体构建

张运峰  
【摘要】: 玉米大斑病是危害玉米的世界性真菌病害之一,在发病年份常造成难以估量的危害和经济损失。前期研究表明,玉米大斑病菌MAPK(mitogen activated protein kinase)基因--STK1(Setosphaeria turcica mitogen activated protein kinase 1)基因,在病菌分生孢子产生、HT-毒素活性和致病性方面有着非常重要的调控作用,但该基因对病菌附着胞发育、渗透胁迫调节,以及在细胞内的功能性定位情况尚不清楚。 本文以玉米大斑病菌菌株01-23和其STK1基因敲除突变体STM-35为供试菌株,明确了STK1基因不影响附着胞的产生,但对附着胞的形态、糖原和脂肪合成有着重要的调控作用,进而从理论上证明STK1基因通过影响附着胞的发育来调控病菌的致病性。为了进一步研究该基因在病菌内的亚细胞定位情况,我们构建了适合ATMT(Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation)转化的STK1-GFP融合基因表达载体,通过PCR、酶切、基因测序和转化酵母后的荧光检测试验,证明该载体的结构和序列准确,能够在真菌中正常表达。 本试验通过插片法分别在盖玻片、洋葱表皮和玉米叶片上诱导附着胞,发现无论是野生型的01-23还是突变体STM-35都会在3种基质上产生附着胞,野生型菌株01-23产生的是典型的、单一的附着胞和多重附着胞,而STM-35突变体产生的附着胞形态多样,在生长的不同阶段出现许多单分支、双杈、多杈和O型附着胞。表明STK1基因的敲除影响了附着胞发育过程中的形态。 本试验通过摸索,初次建立了玉米大斑病菌分生孢子、菌丝和附着胞的oil red O脂肪染色和K2I/K2糖原染色方法。通过oil red O脂肪染色和K2I/K2糖原染色,发现野生菌株01-23的菌丝染色较深,而突变体STM-35的菌丝,脂肪和糖原着色都较浅,糖原和脂肪含量较少,说明STK1基因对菌丝中脂肪和糖原的合成有重要的调控作用。本试验还通过oil red O脂肪染色和K2I/K2糖原染色研究了STK1基因与附着胞发育的关系。在分生孢子萌发形成附着胞的发育过程中,经染色发现,野生菌株01-23分生孢子中贮藏有大量的脂肪和糖原,随着分生孢子的萌发,脂肪和糖原向芽管、菌丝和附着胞内转移,最后在附着胞内保留有大量的脂肪和糖原,而突变体STM-35在附着胞发育过程中,没有发现脂肪和糖原在附着胞中积累,表明STK1基因调控着病菌菌丝和附着胞发育过程中脂肪和糖原的合成和转移方向,进而调控病菌的致病性。 通过比较野生菌株01-23与STK1基因突变体STM-35在不同山梨醇浓度的SPA(Sucrose peptone agar)培养基上生长速度、菌落形态、菌丝形态和01-23分生孢子发育的差异变化,发现山梨醇浓度在1.0~2.0 mol/L范围内,随着浓度增加,菌株01-23生长速度显著降低,但1.0mol/L山梨醇能显著刺激菌株STM-35的生长,随着山梨醇浓度增加,刺激作用逐渐减弱,大于2.0 mol/L时,刺激作用趋于消失。山梨醇浓度变化也影响菌株01-23与突变体STM-35的菌丝形态。随山梨醇浓度的增加,菌株01-23的菌落颜色变浅,菌丝内的原生质发生明显的聚集,出现了密集的颗粒状物和空隙,而突变体STM-35菌株的菌丝颜色却逐渐变浅,出现了少量的颗粒状物,并且在没有在细胞内发现空隙现象。试验结果表明,STK1基因对渗透胁迫条件下的病菌菌丝的生长速度和菌丝形态有一定的调控作用。 利用重组PCR技术构建了适合真菌ATMT转化的pCAMBIA 1300-PSGN (PtrC-STK1-GFP-Nos)表达载体,STK1-GFP融合基因的构建是研究细胞定位和恢复突变体筛选的重要手段,该载体通过PCR、酶切、测序鉴定后,通过ATMT转化入酵母,利用荧光显微镜检测到了能够发出正常绿色荧光的酵母细胞。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S435.13

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