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《河北农业大学》 2010年
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玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析

申珅  
【摘要】: 玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是一种重要的植物病原真菌,引起的玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight,简称NCLB)是威胁玉米生产的一种重要叶部病害,常造成严重经济损失。研究表明,cAMP信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本研究应用候选基因法和Genome Walking技术克隆了玉米大斑病菌的腺苷酸环化酶基因(STAC)的DNA序列,通过基因敲除技术和抑制剂试验创制STAC基因的缺失突变体来研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中STAC基因的功能,初步明确了玉米大斑病菌信号转导途径中的STAC基因在玉米大斑病菌分生孢子产生、附着胞形成、致病性及次生物质代谢调节等方面的重要功能,为进一步研究cAMP信号转导途径在玉米大斑病菌致病过程中的作用提供了理论依据。 利用AC特异性抑制剂MDL-12,330A, Hydrochloride处理玉米大斑病菌孢子悬浮液,结果发现分生孢子的萌发和附着胞的形成均受到抑制。随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成的抑制作用明显增强。初步确定了AC基因在病菌分生孢子萌发和附着胞的形成过程中起重要作用。 根据已知植物病原真菌AC基因的保守核苷酸序列设计简并性引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,扩增获得了AC基因的同源片段。利用Genome Walking技术对所得的基因片段进行延伸,获得了4465bp的STAC DNA序列。Southern杂交确定了STAC基因在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。 利用NCBI网站的PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)软件,对STAC基因进行同源性序列比对,结果发现,与许多真菌,如Pyrenophora tritici-repentis、Aspergillus fumifatus、Neurospora crassa、Cyptococcus neoformans等的AC基因的相似性为58﹪~91﹪。 根据基因同源重组原理,以潮霉素磷酸转移酶基因取代STAC基因的部分编码区序列,构建了含有潮霉素B抗性标记的STAC基因敲除载体。利用重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体,获得了潮霉素B抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,并以潮霉素基因为探针进行Southern杂交验证,最终确定1个转化子为突变体,命名为Δstac,并对突变体菌株Δstac进行了功能分析。其表型分析结果为:突变菌株生长速率较野生型菌株快,气生菌丝颜色变为灰白色,不产生分生孢子,毒素活性明显减弱,致病力下降,且在渗透胁迫条件下,菌株的抗逆能力增强,色素合成发生了改变。由此得出结论STAC基因调控玉米大斑病菌的分生孢子的萌发,附着胞的形成、致病性、渗透胁迫、毒素活性及色素的代谢过程。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S435.131

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