小麦叶锈菌诱导TcLr19的表达分析
【摘要】：
小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病是一种在小麦全生长期发生的主要病害,它的流行会造成严重的减产。种植抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法。Lr19从长穗偃麦草转到普通小麦中,是少数对小麦叶锈病具有普遍抗性的基因之一,至今仍有具大的应用潜力。本研究对叶锈菌诱导的TcLr19进行cDNA-AFLP及EST分析,初步探索小麦抗叶锈病相关基因在接种小麦叶锈菌后0h,3h,6h,12h,16h,20h,24h,30h,36h,48h,72h,96h的表达情况。
应用cDNA-AFLP技术研究TcLr19和Thatcher与小麦叶锈菌05-21-116③(THTS)互作时基因表达的差异。经三次独立实验,在224对引物组合中有58对能够在小麦近等基因系TcLr19和感病对照Thatcher之间扩增出差异条带,多态性引物检出率为25.9%。多态性条带划分为7种类型,其中5种类型可能与抗病相关。对可能与抗病相关的12条片段进行序列测定与分析,经BLASTX比对,8条序列与已知功能基因同源。
随机对叶锈菌诱导的TcLr19 cDNA文库中756个阳性克隆进行测序,获得649条高质量ESTs。对ESTs序列聚类拼接后共获得472条非重复序列(Unisequences)。经BLASTX比对分析,325条(68.9%)非重复序列与已知功能基因同源性很高,115条(24.4%)非重复序列与未知功能基因同源,其余非重复序列尚无同源序列。将全部Unisequences进行功能分类,其中24.3%为未知功能蛋白,20.8%与抗病防御基因及信号转导相关,18.4%与能量和初级代谢基因相关,其余ESTs分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。
以Actin为参照,对cDNA-AFLP分析得到的5条差异片段、EST分析得到的2条信号传导相关基因及3条抗病与防御相关基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明各基因有不同的表达模式,主要包括组成型和诱导型两种。组成型基因在未接菌和接菌材料各时间点表达量基本一致;诱导型基因在接菌后普遍出现表达时间提前且表达量增加的现象。
对获得的抗病相关基因进行分析,推测钙结合蛋白、富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白激酶Pti1、GTP结合蛋白、钙调素等与植物信号转导相关。秆锈抗病类似蛋白、应激相关蛋白、氧化还原酶2OG铁加氧酶家族蛋白、葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶家族蛋白、ABC转运蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、DnaJ蛋白、细胞色素P450、NBS-LRR抗病蛋白、细胞死亡相关蛋白等可能参与TcLr19抗病或防御过程。
以引物P-AT/M-CAC通过cDNA-AFLP扩增得到的特异片段19-9 (168bp)为靶序列,利用特异引物和试剂盒中提供的UPM引物进行3’RACE扩增,得到约2141 bp序列,与靶序列有156bp的重叠区,拼接后得到的2153bp的3’末端序列。经BLASTX分析发现该序列与水稻中富含亮氨酸的类受体蛋白激酶有69%的同源性,推测该基因在植物信号转导过程中负责信号跨膜传递。
本研究利用cDNA-AFLP指纹图谱技术及EST分析技术对小麦叶锈菌诱导的TcLr19表达情况进行全面分析,初步了解参与小麦与叶锈菌非亲和互作过程基因的种类及表达丰度。为探明抗叶锈基因的抗性机制,筛选和克隆抗性基因奠定基础。
【关键词】：小麦叶锈病 TcLr19 抗病相关基因 cDNA-AFLP技术 EST分析 【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S435.121.43
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-10
- 1 引言10-14
- 1.1 小麦抗叶锈病基因的研究进展10
- 1.2 cDNA-AFLP 技术10-11
- 1.3 表达序列标签(EST)技术11-12
- 1.4 半定量RT-PCR 技术12
- 1.5 cDNA 末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)12-13
- 1.6 研究意义13-14
- 2 材料和方法14-26
- 2.1 实验材料14
- 2.1.1 供试小麦14
- 2.1.2 供试菌种14
- 2.2 供试试剂及主要仪器14
- 2.2.1 试剂14
- 2.2.2 仪器14
- 2.3 试验方法14-26
- 2.3.1 植物材料接菌及样品采集14-15
- 2.3.2 RNA 提取及检测15
- 2.3.3 双链cDNA 的合成及检测15-16
- 2.3.4 cDNA-AFLP 分析16-22
- 2.3.5 小麦叶锈菌诱导TcL119 cDNA 文库的EST 分析22
- 2.3.6 半定量RT-PCR 表达分析22-24
- 2.3.7 3′RACE PCR 扩增24-26
- 3 结果与分析26-51
- 3.1 小麦总RNA 的提取26
- 3.2 双链cDNA 的合成26-27
- 3.3 预扩增结果27
- 3.4 选择性扩增结果27-28
- 3.5 TcL119 的cDNA-AFLP 分析28-29
- 3.6 cDNA 差异片段的回收及克隆29-30
- 3.7 差异片段的序列测定及分析30-33
- 3.8 小麦叶锈菌诱导TcL119 cDNA 文库的EST 分析33-46
- 3.8.1 ESTs 序列的质量评价33
- 3.8.2 ESTs 聚类及拼接33-34
- 3.8.3 ESTs（Unisequences）功能注释及分类研究34-45
- 3.8.4 基因表达频率分析45-46
- 3.9 半定量RT-PCR 表达分析46-48
- 3.9.1 cDNA-AFLP 分析所得差异片段的表达分析46-47
- 3.9.2 cDNA 文库中ESTs 序列的表达分析47-48
- 3.10 3′RACE48-51
- 3.10.1 3′RACE PCR 扩增48
- 3.10.2 3′RACE 的序列分析及电子克隆48-51
- 4 讨论51-57
- 4.1 小麦叶片总RNA 的提取51
- 4.2 利用cDNA-AFLP 技术分析小麦TcL119 差异表达的可行性51
- 4.3 对cDNA 文库进行 EST 分析的可行性51
- 4.4 小麦与叶锈菌互作过程中的抗病相关基因51-55
- 4.4.1 抗病信号转导途径52-53
- 4.4.2 膜转运类基因53
- 4.4.3 抗病与防卫反应基因53-55
- 4.5 半定量RT-PCR55
- 4.6 3′RACE PCR 扩增55-56
- 4.7 后续工作56-57
- 5 结论57-58
- 参考文献58-65
- 附录A65-67
- 附录B67-68
- 附录C68-70
- 在读期间发表的学术论文70-71
- 作者简介71-72
- 致谢72-73
|
|
|
|
| 1 |
何家泌;梁国林;李菊梅;;河南省小麦叶锈菌生理专化研究[J];河南农业大学学报;1982年04期 |
| 2 |
;叶部病害[J];麦类文摘;1995年05期 |
| 3 |
邓福友,汪宜萱;小麦叶锈菌群体分析——同培养物不同夏孢子堆后代的致病异质性研究[J];植物病理学报;1984年04期 |
| 4 |
Statler G.D.;文成敬;;小麦叶锈菌小种1的培养物70—1致病性遗传[J];麦类作物学报;1981年02期 |
| 5 |
杨文香,王焕如,朱之堉;在小麦叶锈菌生理分化研究中以基因鉴定代替小种鉴定[J];植物病理学报;1991年04期 |
| 6 |
赤国彤,白凤红,朱之堉;介绍一种小麦叶锈菌夏孢子的单孢分离法[J];植物保护;1992年01期 |
| 7 |
郭爱国,赤国彤,李青松,霍云萍,朱之堉;河北省小麦叶锈菌群体毒性基因组成分析[J];河北农业大学学报;1993年03期 |
| 8 |
汪可宁,刘美因,谢水仙,李凤春;我国小麦叶锈菌生理小种专化研究[J];植物病理学报;1982年03期 |
| 9 |
;小麦叶锈菌危险性洛10类群在发展[J];河北农业大学学报;1982年03期 |
| 10 |
曹丽华;徐世昌;陈万权;刘太国;蔺瑞明;;小麦叶锈菌的特异性分子诊断检测技术[J];植物保护学报;2007年06期 |
|
快捷付款方式
订购知网充值卡
订购热线
帮助中心