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《三峡大学》 2009年
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重组钙网蛋白用于抗肿瘤免疫治疗的实验研究

曹春雨  
【摘要】: 目的:克隆小鼠钙网蛋白(calreticulin, CRT)基因编码区,并在大肠杆菌E.coli中诱导性表达。用纯化后的小鼠重组钙网蛋白(rCRT)包被凋亡的肿瘤细胞,然后研究这种rCRT包被的肿瘤细胞作为免疫原激发机体特异性抗肿瘤免疫应答的效用。本研究的目的是探索抗肿瘤免疫治疗的新途径。 方法:(1) RT-PCR技术用于克隆小鼠CRT基因编码区,并克隆入原核表达质粒pET-15b中。上述质粒转化E.coli后,用IPTG诱导rCRT表达,经Ni-NTA亲和层析获得纯化的rCRT。(2) MTT法用于选择凋亡诱导药物的最适药物浓度和作用时间,DNA片段化分析检测细胞凋亡情况,荧光实时定量PCR法和Western blotting法检测药物处理前后细胞内CRT基因表达变化。(3)细胞免疫荧光技术检测药物处理前后肿瘤细胞内CRT的亚细胞定位变化。(4) Balb/C小鼠随机分组后分别用米托蒽醌诱导凋亡、BENS诱导凋亡和BENS诱导凋亡并用rCRT包被的肿瘤细胞免疫接种,然后观察免疫接种对随后接种的肿瘤活细胞生长的抑制作用。(5) LDH释放实验检测免疫接种小鼠脾细胞对B16-F1细胞和小鼠H22肝癌细胞的杀伤效应。 结果:(1)成功克隆昆明小鼠CRT基因编码区,并在大肠杆菌E.coli中表达和纯化获得小鼠rCRT。(2) MTT分析表明,药物BENS和米托蒽醌均能抑制小鼠黑色素B16-F1细胞生长,且抑制率呈时间和药物浓度依赖性。DNA片段化分析证实,两种药物均可诱导B16-F1细胞发生凋亡。(3)两种药物处理均不引起细胞内CRT基因表达的明显变化,但米托蒽醌处理后的B16-F1细胞发生CRT从细胞质到细胞膜的转位和簇集,而BENS处理后的B16-F1细胞没有类似变化。(4)以米托蒽醌诱导凋亡的B16-F1细胞和BENS诱导凋亡并用rCRT包被的B16-F1细胞作为免疫原免疫小鼠,能抑制后续接种的同种肿瘤的生长。(5) LDH释放实验结果表明:以米托蒽醌诱导凋亡的B16-F1细胞和BENS诱导凋亡并用rCRT包被的B16-F1细胞作为免疫原免疫小鼠后,两组小鼠的脾细胞对B16-F1活细胞的杀伤活性明显高于对照组。而对无关肿瘤细胞H22细胞的杀伤活性没有明显差异。 结论:基因重组CRT有效包被的凋亡肿瘤细胞能用作细胞抗原,在实验动物体内诱导出特异性的抗同种肿瘤的免疫杀伤活性。本研究提示了重组CRT在抗肿瘤研究中重要的潜在应用价值,并为肿瘤治疗和预防提供了新的思路。
【学位授予单位】:三峡大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R730.5

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