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《南方医科大学》 2015年
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婴幼儿隐匿性乙型肝炎病毒感染的分子生物学特征分析

周姗  
【摘要】:研究背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是危害人类健康的重大传染病之一。据统计全球约有20亿人曾感染过HBV,其中慢性HBV感染者约为3.5亿人,估计每年约有100万人死于因HBV感染所导致的相关疾病,如肝硬化、肝衰竭和原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。我国是HBV感染的高流行地区,HBV携带者达9300万人,其中慢性乙肝患者达2500万,成为我国最为重要的三大传染病之一,也是引起HCC主要原因。近十年来,隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection, OBI)广泛受到输血医学及临床工作者的重视。定义为表面抗原检测阴性,而血清或肝脏组织中HBV DNA检测为阳性,实为乙型肝炎病毒(HBV)的一种潜伏性感染形式,而且是输血、器官移植、血液透析传播乙肝病毒的重要原因。我国慢性乙型肝炎感染主要是由围生期母婴传播导致,由于新生儿免疫系统尚未发育成熟,容易导致免疫耐受而产生慢性感染,随着年龄增长发展为肝硬化、肝癌的几率也显著升高。不但在输血传播疾病中OBI广泛受到关注,自2008年以来越来越多的各国研究人员开始关注母婴传播OBI的分子免疫机制。OBI可发生于乙型肝炎表面抗体/乙型肝炎核心抗体(anti-HBs/anti-HBc)阳性人群,也可发生于anti-HBs/anti-HBc阴性人群中,其检测结果主要依赖于检测乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus antigen,HBsAg)和HBV DNA试剂的灵敏度。研究表明,OBI形成最常见的原因是HBV基因变异尤其是S区及前S区变异,可影响HBV蛋白的表达,导致HBsAg阴性,或者引起抗原表位构相变化,影响抗原抗体反应,导致试剂难以检测。导致OBI的其他原因还包括HBV其他结构区域变异,如X区变异,前C和C区变异等;另外,HBsAg分泌障碍导致大量HBsAg滞留在内质网不能分泌到胞外,从而导致HBsAg阴性的假象。再次,其他病毒感染的干扰,如HBV与其他嗜肝性病毒或者HIV重叠感染,也可相互影响导致HBV复制受到限制呈现出HBsAg阴性的感染状态。在Pre-s/s区的任一突变都可以导致改变HBsAg的抗原性并且会抑制anti-HBs的产生。该区域的第124到147氨基酸序列包含“a”决定簇和包含应答anti-HBs显性B细胞抗原簇。一个氨基酸在这个区域的替换突变就会间接破坏anti-HBs的循环产生,导致人群在接种乙肝疫苗后发生变异性感染,或者发生OBI。在急性乙型肝炎发生早期,HBV可自由地以免疫复合物形式存在。随后,在HBsAg转向anti-HBs后就转化为免疫复合物为主,这表明血清中的HBV DNA与anti-HBs形成免疫复合物也会致使OBI的发生和发展。研究目的:本研究通过对HBsAg阳性孕妇生产的婴幼儿进行跟踪随访,以探究经乙肝疫苗主被动免疫和高效价乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B immunoglobulin, HBIG)被动免疫以后,婴幼儿乙型肝炎与隐匿性乙型肝炎感染的发生率及其分子免疫特征,进而为乙肝或OBI的预防、临床发生发展和个性化治疗方案提供理论指导。研究方法:本研究采集乙肝表面抗原阳性的母亲及其分娩的婴幼儿出生至少3个月以上后的血浆样本,并在48个月内进行随访,第二次采集血液样品。婴幼儿样本在南方医院肝病中心使用美国雅培公司试剂盒采用化学发光法(CMIA)进行HBsAg定量( 0.05IU/ml为阴性),anti-HBs的定量 ( 10mIU/ml为阴性),HBeAg (S/CO值1为阴性)的检测。在厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗技术工程研究中心(NIDVD)采用EIA进行全部样品的anti-HBc的定量检测,核酸标准品来自于英国NIBSC。应用广州达瑞公司乙型肝炎病毒e抗原时间分辨免疫荧光试剂盒对母亲样本进行HBeAg的定量。采用罗氏公司高纯度核酸提取试剂盒提取血清HBV DNA核酸,根据文献,采用高灵敏度的巢式PCR和QPCR等的方法进行HBV PreS/S、S区和BCP/PC区的扩增,扩增使用的Taq酶为Takara公司的rTaq和La-Taq酶。扩增产物经罗氏公司切胶纯化回收试剂盒回收后送立菲公司进行Sanger测序,测序仪器为A.B13730。获得序列经Seqman和MEGA6序列分析软件进行比对和进化分析。从Genbank基因数据库选取我国B型,C型和D型HBV野毒株全基因序列作为参考序列进行比对分析。翻译成蛋白质进行突变分析,系统进化树方法对所得样本的基因型进行分型。对于有疑问的样本进行T载体克隆并分析鉴定。应用高灵敏度的实时荧光定量(QPCR)方法对婴幼儿和母亲样本分别进行HBV DNA定量,标准品来自于英国NIBSC,灵敏度可达5IU/ml。研究结果:1.目标人群:本研究共纳入77位婴幼儿及儿童,年龄分布3-96个月,共采集到92份样本,其中62位只有1次随访抽血,15位有2次随访抽血。并收集到62位HBsAg日性母亲的68份血浆样本,其中56位只有1次随访抽血,6位是进行了2次随访抽血。同时还收集到6份HBsAg阳性母亲的脐带血样品。纳入的母亲平均年龄28岁。本研究中涉及到的新生儿乙肝疫苗接种率为100%,疫苗接种时间为产后24小时之内,同时在与乙肝疫苗不同侧臀部注射高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)进行被动免疫。2.血清学指标: (1)对婴幼儿样品检测发现,3.9%(3/77)HBsAg阳性患儿,其余均为HBsAg阴性; 11.7%(9/77)HBeAg阳性:2.6%(2/77)HBsAg阴性/HBeAg阳性/HBV DNA阴性;5.2%(4/77)HBsAg阴性/anti-HBs阴性/anti-HBc阴性。共有14.3%(11/77)anti-HBs水平大于1000mIU/ml,其中91%(10/11)都是在出生后6个月接种第三针乙肝疫苗以后检测的,anti-HBs在小于6个月、6-12个月、大于12个月各年龄阶段中位数分别为169.8 (57.9-289.7) mIU/ml,387.7 (152.3-1301.2) mIU/ml,142.2 (49.1-498.8) mIU/ml。共有80%(74/92)婴幼儿样本检测anti-HBc阳性,从6个月以后anti-HBc水平显著下降,18个月以后普遍降至为阴性。 (2)对母亲样本检测发现,40.3%(25/62) HBeAg阳性。 (3)对6例脐带血检测发现,1例HBsAg为弱阳性,有3例HBeAg阳性,anti-HBc全部阳性。3. HBV DNA检测: (1)在89份HBsAg阴性血浆样本中(含59份初次采集样品和15份第二次随访采集样品),其中20份样品扩增出了BCP/PC片段,第2次随访样本HBV DNA均为阴性,所有样本Anti-HBs值均为阳性(10mIU/ml),同时有4份样品的HBeAg值是阳性(1 S/CO)。共发现87处突变,其中3例发现A1762T/G1764A双突变,8例发现了G1896A,但是这8例均为HBeAg阴性,同时还发现G1752A, A1846T, T1858C等处突变。(2) HBsAg阴性样品中共有13份样品扩增出了S片段,同样没有第2次随访血液样本,有8例同时扩出了BCP/PC和S两个片段。Anti-HBs值均为阳性(10mIU/ml), Anti-HBc也全部为阳性。其中3例HBeAg阳性。在S片段共发现8处氨基酸突变,分别为G45E、T139L、T47A、S53L、C76S、 Q101R, T125M和P127T,未发现重要的V39A、P41H、E64K、G145R突变。(3)92份样本(上述89份样品,再加3份初次随访HBsAg阳性样品)中HBsAg阴性经QPCR检测后HBV DNA阳性(病毒载量,viral load,VL 5IU/ml)的样品共有13例,Anti-HBs也均为阳性(10 mIU/ml),且HBeAg都为阴性(1 S/CO),有4例是BCP/PC,S和VL均为阳性,其中BCP/PC或者S阳性和VL阳性的有5例。(4)6例脐带血中有1例巢式PCR扩增S片段为阳性。 (4)S基因序列母婴比对:对HBsAg阳性的3例婴儿样品进行分析,样品B75的S片段的与其母亲的比较有4个碱基不一致,分别是357位,381位,480位,636位,导致4个氨基酸变异,分别为T68I, Y76C, Q109L,Y161F。而B74和B76与其母亲的HBV S片段氨基酸完全一致。通过系统进树分析,13例HBV DNA S片段阳性样品中B基因型10例,C基因型2例,D基因型1例。与12位母亲获得相应的HBV S序列比对发现,有6对母婴序列高度一致并且基因型相同,但是另外6对母婴HBV S序列与基因型不同。研究结论:对广州市南方医院(三甲级)HBV母婴传播调查显示,母亲为乙肝表面抗原阳性的新生儿出现HBsAg阳性的比率为3.9%(3/77),出现HBeAg阳性的比率为11.7%(9/77),出现HBV DNA阳性的比率为36.4%(28/77)。由于第2次48个月内随访采集的血液样本中未发现HBV DNA阳性样品,因此本研究调查中所有的HBsAg阴性,HBV DNA阳性的婴幼儿认为是一过性OBI感染状态,未发现持续性OBI,根据OBI判定标准,其中18.2%(14/77)确定为一过性OBI。在目前的医疗新生儿24小时内联合接种乙肝疫苗和HBIG并按计划完成疫苗免疫可以有效阻断96%以上HBV母婴传播。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R725.1

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