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《南方医科大学》 2015年
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2-甲氧基雌二醇对脊髓损伤大鼠神经功能、TAU蛋白影响及对急性脑梗死大鼠神经功能影响的实验研究

张鸿日  
【摘要】:脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)可由外伤、出血、肿瘤压迫等多因素引起,是临床工作中常见的神经外科疾病,可严重影响患者及家属的生活质量。近年来矿难,重大交通事故,自然灾害频发,脊髓损伤可成批发生且伤情严重复杂,并发症多,预后差,甚至造成患者终生残废或危及生命。目前治疗脊髓损伤常用方法包括手术治疗,细胞移植,药物治疗,基因工程等疗法,其中药物治疗中激素冲击疗法广为使用,但因其可发生较多的副作用而受到限制。早期应用大剂量激素冲击疗法已经在脊髓损伤中的神经康复作用得到肯定。早期治疗脊髓损伤最广泛应用的药物代表是地塞米松和甲强龙,得到了广大临床工作者的推广。激素可以减轻细胞水肿、改善血液循环、抑制炎症、降低毒性物质的释放等。但是大剂量激素的应用可能带来较为严重的并发症如血糖升高,水电解质紊乱和应激性溃疡等,因此在临床上只能短时间冲击治疗。寻找其他药物替代地塞米松及甲强龙治疗脊髓损伤越来越受到临床医生的关注。近年来有报道雌激素及黄体酮对可以改善脊髓损伤大鼠的神经功能,但作用机制不明确。我国中医中药治疗脊髓损伤也获得一定疗效,尤其是活血化瘀的药物,但有些药物缺乏循证医学的论证,对于副作用的评价也不完善。2-甲氧基雌二醇(2ME2)是激素雌二醇的天然代谢产物,存在于人体的血液中。目前的研究表明其有一定的抗肿瘤及神经保护作用。因其毒性作用小,受到越来越多专家学者的关注。近年来2ME2通过减少神经细胞凋亡、减轻神经细胞水肿等对缺血缺氧性脑病具有治疗作用已经得到了广泛的认可。脊髓损伤也可导致神经细胞的变性、坏死;损伤后组织缺血缺氧、内环境变化及血管内有害物质的聚集可造成脊髓后续的损害。目前关于2ME2是否对脊髓损伤大鼠具有一定治疗作用的相关报道较少。本实验通过2ME2治疗急性脊髓损伤大鼠,检测脊髓损伤大鼠的运动功能,观察其治疗作用,并探讨其可能的机制。Tau蛋白是微管相关蛋白,其主要功能是与微管蛋白结合,维持微管的稳定同时诱导微管形成。Tau蛋白诱导与促进微管蛋白聚合成微管,并与新聚合的微管结合在一起,保持微管相互之间的距离,影响神经元蛋白激酶的附着点,在神经元可塑性方面起重要的作用。目前已证实老年痴呆症患者的神经元中Tau蛋白总量多于正常人,且有功能的Tau蛋白较常人减少。近年来研究发现,脑缺血缺氧性脑病与神经细胞内的Tau蛋白含量及磷酸化水平关系密切,Tau蛋白含量增伴随过度磷酸化可致神经元微管结构受破坏,正常轴突转运受损从而引起神经元功能损伤。在脊髓损伤的过程中神经细胞也存在微管的损害,但与Tau蛋白及磷酸化水平的变化关系目前研究较少,因此我们希望通过检测脊髓损伤后组织Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白的含量,来探讨脊髓损伤与Tau蛋白的关系。Hung KS等发现大鼠脊髓损伤后Tau蛋白磷酸化水平增加,经过治疗后Tau蛋白磷酸化水平下降,并提出Tau蛋白磷酸化水平与脊髓损伤的程度正相关。我们在实验中发现2ME2对急性脊髓损伤有治疗作用,能改善脊髓损伤大鼠的运动功能,减少神经细胞调亡;因此我们希望通过检测经2ME2治疗前后Tau蛋白磷酸化水平的变化,探讨2ME2治疗脊髓损伤可能存在的机制。急性脑梗死在我国发病率高、致死率高,是严重威胁人体健康的疾病类型之一。急性脑梗死发作时,脑动脉梗阻,脑组织血液供应发生障碍,导致局部脑组织因缺血缺氧发生坏死或软化。但是在梗塞病灶周围存在可逆的缺血半暗带区,该区域的组织在功能上呈现可逆性损害,这部分组织细胞仍呈现正常的组织结构,但在生理功能上存在缺陷,这部份细胞在不利的环境中可变性死亡,但如果在好的环境下可以恢复正常功能。目前临床研究都集中在梗塞周边的神经保护治疗。有报道2ME2对脑缺血缺氧具有保护作用,包括抑制神经细胞凋亡,减轻神经细胞水肿等,对缺血缺氧性脑病具有一定的保护作用。因此本实验研究2ME2对急性脑梗死大鼠脑组织神经的影响,旨在为临床治疗急性脑梗死提供一定的理论依据。急性脑梗死发作时,因为缺血缺氧、梗塞后水肿压迫、自由基聚集、细胞代谢障碍等多种复杂因素导致梗塞周边神经细胞处于凋亡状态。而细胞的凋亡则是由基因调控细胞程序性死亡的过程。控制细胞凋亡的基因分为促凋亡基因和抗凋亡基因两大类。两类基因的活跃程度决定了神经细胞的凋亡。Caspase-3、bcl-2家族、Fas等属于促凋亡基因,其中caspase-3在神经细胞凋亡通路上扮演着重要的角色。Adam Hafeez等在研究大鼠急性脑梗死模型时发现,缺血缺氧可以诱导神经细胞的凋亡,导致神经元的丢失。并检测到了大鼠脑梗死周围组织的caspase-3表达增加。因此我们在实验中通过TUNEL染色检测凋亡及检测caspase-3来验证2ME2对急性脑梗死的凋亡的影响。第一章 2ME2对脊髓损伤大鼠神经功能及脊髓神经细胞凋亡的影响目的:研究激素雌二醇的代谢产物2-甲氧基雌二醇(2ME2)对脊髓损伤(SCI)大鼠神经功能及神经细胞凋亡的影响。方法:将成年雄性SD大鼠72只随机分为3组:假手术组(n=24)、脊髓损伤(n=24)和脊髓损伤2ME2治疗组(n=24)。采用改良的Allen's法制作脊髓损伤模型。从脊髓损伤大鼠模型建立后第一天开始,脊髓损伤治疗组大鼠按24mg/kg给予2ME2腹腔注射,连续注射7天。脊髓损伤组大鼠给予等剂量生理盐水腹腔注射,假手术组不给予干预措施。应用BBB评分系统对大鼠第1d,3d,7d,14d,21d,28d后肢运动功能进行评估。第7d应用免疫荧光染色检测caspase-3表达。第7d通过TUNEL凋亡原位检测试剂盒检测神经细胞凋亡结果:脊髓损伤组和脊髓损伤2ME2治疗组BBB评分明显低于假手术组,差异具有统计学意义(P0.05),脊髓损伤2ME2治疗组在14d、21d、28d BBB评分明显高于脊髓损伤组,差异具有统计学意义(P0.05)。说明2ME2可以改善脊髓损伤大鼠的神经功能恢复。脊髓损伤组及脊髓损伤2ME2治疗组随着时间的推移,功能在恢复,各个时间点的评分存在差异,具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色结果显示,脊髓损伤组(25.13±3.64)及脊髓损伤治疗组(15.89±4.68)caspase-3蛋白表达阳性细胞数较假手术组(3.32±2.11)显著增加,差异具有统计学意义(P0.05),脊髓损伤2ME2治疗组caspase-3蛋白表达阳性细胞数较脊髓损伤组显著减少,差异具有统计学意义(P0.05)。(个/高倍视野,×400)。TUNEL染色观察脊髓神经组织细胞凋亡显示:与假手术组(2.05±1.54)相比,脊髓损伤组(40.62±5.02)及脊髓损伤2ME2治疗组(18.79.62±3.28)凋亡细胞数显著增多,差异具有统计学意义(P0.05),脊髓损伤2ME2治疗组凋亡细胞指数较脊髓损伤组显著减低,差异具有统计学意义(P0.05)。证明2ME2可以改善神经功能,抑制神经细胞凋亡。结论:2ME2改善脊髓损伤大鼠模型脊髓损后的运动功能,具有神经保护作用;2ME2降低脊髓损伤大鼠模型脊髓损后caspase-3蛋白表达,抑制神经细胞凋亡。第二章脊髓损伤大鼠TAU蛋白的变化及2ME2对TAU蛋白磷酸化的影响目的:通过检测脊髓损伤(SCI)后脊髓组织Tau蛋白的变化,并检测SCI2ME2治疗脊髓损伤大鼠前后脊髓组织Tau蛋白磷酸化水平的变化;探讨脊髓损伤与Tau蛋白的关系及2ME2治疗脊髓损与Tau蛋白磷酸化的关系。方法:将成年雄性SD大鼠72只随机分为假手术组(Il=24)、脊髓损伤组(n=24)和脊髓损伤2ME2治疗组(n=24)3组,采用改良的Allen's法制作脊髓损伤模型。从脊髓损伤大鼠模型建立后第一天开始,脊髓损伤治疗组大鼠按24mg/kg给予2ME2腹腔注射,连续注射7天。脊髓损伤组大鼠给予等剂量生理盐水腹腔注射,假手术组不给予干预措施。在第7d将提取大鼠脊髓标本,应用免疫荧光检测p-Tau(Ser 262)蛋白,应用Western blot技术检测p-Tau(Ser 262)蛋白表达水平。结果: 免疫荧光检测p-Tau(Ser 262)阳性细胞数量(个/高倍视野,x400)显示:脊髓损伤组(19.05±1.34)和脊髓损伤2ME2治疗组(10.36±1.28)脊髓损伤后p-Tau(Ser 262)蛋白表达与假手术组(5.21±1.03)相比增加,差异有统计学意义(p0.05)。说明脊髓损伤后,脊髓组织中的Tau蛋白表达增加。脊髓损伤治疗组p-Tau(Ser 262)蛋白表达与脊髓损伤组相比明显减少,差异具有显著意义(p0.05)。2ME2对脊髓的作用可能通过降低Tau蛋白磷酸化水平来实现。为了进一步验证实验的可靠性,我们应用Western blot检测p-Tau(Ser262)蛋白光密度。Western blot结果显示,脊髓损伤组(0.607±0.105)和脊髓损伤治疗组(0.283±0.094)p-Tau(Ser 262)蛋白表达较假手术组(0.099±0.016)增加,差异有统计学意义(p0.05),脊髓损伤治疗组p-Tau(Ser 262)蛋白表达与脊髓损伤组相比明显减少,差异具有显著意义(p0.05)。结论:脊髓损伤后脊髓组织Tau蛋白表达增加;经2ME2治疗后脊髓组织磷酸化的Tau蛋白水平降低。第三章 2ME2对急性脑梗死大鼠神经功能的影响目的:探讨2ME2对急性脑梗死大鼠脑组织神经功能及细胞凋亡的影响。方法:72只大鼠随机分为假手术组、脑梗死组和2ME2治疗组3组。每组大鼠24只。在采用线栓法制作大鼠大脑中动脉脑梗死模型24h后治疗组按24mg/kg给予2ME2腹腔注射,连续注射7天。脑梗死组大鼠给予等剂量生理盐水腹腔注射,假手术组不给予干预措施。第7天对大鼠进行神经功能分析。第7天处死大鼠,免疫荧光检测大鼠脑组织中凋亡相关基因Caspase-3的表达情况,通过TUNEL凋亡原位检测试剂盒检测神经细胞凋亡。通过TTC染色观察脑组织梗死范围变化。结果:Bederson标准评分结果显示:与假手术组(0.333+0.492)比较,脑梗塞组(2.000±0.8543)和2ME2治疗组(1.250±0.866)大鼠神经功能评分显著升高(P0.05)。而在2ME2治疗的大鼠中,其评分较模型组明显下降(P0.05)。不同处理组大鼠脑组织中Caspase-3水平比较结果显示:与假手术组(0.252±0.079)比较,模型组(1.065±0.134)和治疗组(0.691±0.136)大鼠脑组织中Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05)。而在2ME2治疗的大鼠中,其脑组织中Caspase-3表达水平较模型组明显下降(P0.05)。大鼠建模后7天脑组织细胞凋亡数量较多,而经过2ME2治疗的大鼠脑组织中细胞凋亡数量较少,对凋亡水平和进行定量分析显示,与假手术组(42.750±8.572)比较,模型组(161.917±10.850)大鼠脑组织中凋亡细胞数显著性增加(P0.05)。而治疗组(82.417±8.702)大鼠脑组织中凋亡细胞数较模型组则显著性下降(P0.05),但是其水平仍然显著高于假手术组(P0.05)结论:2ME2可以改善急性脑梗死大鼠的神经功能,降低大鼠脑组织神经细胞凋亡水平,对神经具有一定保护作用,为临床急性脑梗死治疗提供了一定的参考依据。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R651.2;R743.3

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