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Erbin对焦虑和抑郁样行为的调节作用及其机制研究

罗争意  
【摘要】:精神疾病是一类严重危害人类健康的疾病,抑郁症的终生发病率为17%,而焦虑症的终生发病率更高达28%。在世界范围内,抑郁症及其相关障碍所造成的经济负担以及致残率已高居首位。大量研究表明焦虑症和抑郁症具有明显的相关性,焦虑症是抑郁症的一个促进因素,如90%的焦虑症患者有抑郁症;而抑郁症共患焦虑症也达到50-60%;并且抗抑郁药对焦虑症也有治疗效果。提示这二种疾病可能有共同的病理机制,但目前对此尚不清楚。因此,揭示焦虑症和抑郁症的共同病理机制,有助于发现新的药物靶点,这是当前焦虑症和抑郁症防治研究中的关键科学问题之一。GABA系统与焦虑症和抑郁症的发生密切相关GABA能神经系统是中枢神经系统中的主要的抑制性神经系统,而在中枢神经系统中GABAA受体是GABA递质的主要受体,它主要介导快速的GABA递质传导。GABAA受体是一个异五聚体,组成GABAA受体的亚基多达19种,经典的GABAA受体一般是由2个a亚基,2个p亚基和1个丫亚基组成的,在中枢神经系统中含有γ2亚基的GABAA受体占总的GABAA受体的90%以上。在动物上通过基因操控和药物等多种手段表明γ2亚基功能的改变和焦虑症以及抑郁症密切相关。通过对Gad67和Gad65(GABA合成过程中的关键酶)的研究表明GABA的合成以及传递参与了焦虑行为的调节。BZ(Benzodiazepines苯二氮平类药物),一种GABA的激动剂,同时也是一类经典的抗焦虑的药物,这进一步支持GABA能系统异常参与了焦虑症的病理过程。大量临床资料表明,重度抑郁症患者GABA水平和GABAA受体都发生显著改变;应激(stress)是导致抑郁和焦虑的重要原因,GABA能系统是控制应激反应的重要因素,同时慢性的应激损害GABA能系统;一些经典的抗抑郁药能促进GABA的释放以及Gad67的表达上调。这些研究结果表明GABA机制对于抑郁和焦虑具有重要的调节作用,同时也表明GABA系统异常参与了抑郁和焦虑的病理机制。Erbin调节GABA系统的兴奋性输入Erbin又称ErbB2相互作用蛋白,其分子量为200 KDa。我们前期的工作发现它在神经系统表达,并与突触后蛋白PSD-95相结合,其C末端含有1个PDZ结构域,N末端含有16个LRR结构域,属于LAP蛋白家族。近年来,我们发现Erbin能与信号蛋白MAPK、Ras及TGFp相互作用,从而参与多条信号通路传导的调控,Erbin还参与NRG1信号通路对外周神经髓鞘化形成的调节。最近,我们发现Erbin特异性地表达在GABA能中间神经元的兴奋性突触后膜上,并且主要是在PV的中间神经元上;Erbin能够结合TARPγ-2,从而调节AMPA受体的上膜,而GABA能系统异常在焦虑和抑郁的发生中具有重要的作用。杏仁核是焦虑症的发生的重要脑区,mPFC是抑郁症发病的关键脑区杏仁核是大脑边缘系统的重要组份,其包含5个主要的核团,协调多个脑区管理情感行为(如恐惧和焦虑)的不同方面。而BLA(basolateral amygdala)在调节焦虑行为中起重要作用,它是杏仁核中的信号输入核团。已有大量研究表明,增强或者是降低BLA的神经元的兴奋性和焦虑行为的表达十分相关。而且临床试验显示,焦虑症患者的杏仁核内部以及杏仁核和其他脑区之间的联系有显著的异常。中间前额叶皮层(medial prefrontal cortex mPFC)是调节抑郁症的主要脑区,首先抑郁症的发病和,mPFC的神经元活动密切相关; 而且脑成像实验表明抑郁症患者与正常人的mPFC成像存在着显著的差异;应激(stress)是导致抑郁的重要原因,应激刺激后中间前额叶皮层的神经元的兴奋性、神经元的形态以及一些蛋白的转录状态都有显著的变化。以上的证据说明杏仁核和中间前额叶皮层分别是焦虑和抑郁行为调节的主要脑区。因此,我们提出了我们的假说:Erbin通过GABA能系统参与调控动物的焦虑和抑郁样行为;而且因为Erbin特异性地分布在PV神经元上,进而,我们提出PV神经元参与焦虑和抑郁的调控,是焦虑和抑郁并发症的重要机制。Erbin对焦虑样行为的调节作用及其机制研究首先,我们观察了ErbinΔc/Δc小鼠的焦虑样行为表现:首先我们进行了高架十字迷宫实验(Elevated-plus maze test),在高架十字迷宫实验中我们发现:ErbinΔc/Δc小鼠相对于野生型小鼠,在开臂中停留的时间显著减少,而在闭臂中停留的时间显著增加,而且两组小鼠在迷宫中的运动路程没有显著的差异,说明ErbinΔc/Δc小鼠闭臂内停留时间的增加并不是小鼠的运动能力造成的。接着我们检测了开放场实验(Open field test),开放场实验表明相对于野生型的小鼠,ErbinΔc/Δc小鼠在中央停留的时间显著减少,同时两组小鼠的运动路程没有显著的差异,说明ErbinΔc/Δc小鼠中央停留时间的增加并不是小鼠的运动能力造成的。最后我们开展了新环境抑制进食实验(Novelty-suppressed feeding test),新环境抑制进食实验中发现ErbinΔc/Δc小鼠进食前探索时间显著增加,但是5min的进食量则没有显著的差异,说明ErbinΔc/Δc小鼠进食前探索时间显著的增加并不是小鼠的不同的饥饿程度造成的。以上三个经典的焦虑行为检测实验均表明ErbinΔc/Δc小鼠相对于同窝野生型的小鼠有显著的焦虑样行为。接着,根据以往的研究表明GABA能系统在焦虑和抑郁的调控有着非常重要的作用,而且杏仁核的BLA区(Basolateral amygdala)是焦虑症的发病中的关键脑区。因此,我们探讨了Erbin对BLA区的GABA系统的调控作用。据我们实验室前期的工作表明,Erbin能够特异性地调控中间神经元的兴奋性输入,所以我们根据假说进一步检测了BLA区GABA神经元上的微兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs),为了记录PV神经元,首先我们用的小鼠为Erbin突变小鼠和Gad-67-GFP的小鼠杂交后代,并且我们选用了Erbin突变的纯合子和野生型而且都含有GFP的小鼠,这样我们选择带绿色荧光的细胞做电生理记录,因为GFP阳性的细胞都是中间神经元。同时我们还检测了神经元的动作电位,因为PV神经元中有一大部分为fast spiking的神经元。实验结果显示ErbinΔc/Δc小鼠]mEPSCs的幅度显著降低,而频率没有显著的变化,并且兴奋性突触后电流(EPSC)的pair pulse ration (PPR)也未见显著变化,提示ErbinΔc/Δc小鼠BLA区GABA神经元兴奋性突触后膜上的AMPA受体数量变少。其次,我们发现ErbinΔc/Δc小鼠BLA区的锥体神经元的兴奋性显著增加。以往的研究表明神经元的兴奋性增加导致了动物的焦虑水平的增加,而且锥体神经元的兴奋性与GABA系统的抑制作用有重要的关系。根据这一理论我们检测了BLA区锥体神经元的兴奋性,通过对注入电流诱发动作电位的分析,我们发现ErbinΔc/Δc小鼠锥体神经元的兴奋性显著升高,具体表现为在相同电流刺激下动作电位的发放数目显著增加,而且诱发第一个动作电位时给予的电流刺激的大小显著降低。我们知道神经元的兴奋性的改变大致有以下三个方面的原因:神经元的本身一些特性(如静息电位、动作电位的阈值);二、其他一些神经元的兴奋性输入;三、周围的中间神经元的抑制性输入。我们进一步分析发现ErbinΔc/Δc小鼠相对于野生型小鼠来说,其静息电位水平以及动作电位的阈值未见显著的变化,这个说明兴奋期的改变并不是由神经元本身的特性造成的。再次,我们发现ErbinΔc/Δc小鼠BLA区的锥体神经元的兴奋性输入没有显著变化。谷氨酸能神经系统是中枢神经系统的最主要的兴奋性系统,所以我们检测了锥体神经元的自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs),结果显示突变型和野生型小鼠之间无论是频率还是幅度均无显著的差异,这排除了锥体神经元兴奋性水平改变是由于谷氨酸能兴奋性传入变化所致。通过上面的三个实验结果,我们不难得出ErbinΔc/Δc小鼠的兴奋性水平的改变可能为其周围的抑制性系统的改变而引起的。我们通过降低抑制性输入进一步探讨ErbinΔc/Δc小鼠BLA区的锥体神经元的兴奋性显著增加的原因。上面数据说明GABA能系统很有可能就是导致锥体神经元兴奋性升高的原因,我们用GABAA受体的阻断剂BMI阻断GABA能系统的传入,结果发现突变型和野生型小鼠之间的锥体神经元兴奋性差异被消除。进一步说明GABA能系统是导致锥体神经元兴奋性升高的原因。因此我们在ErbinΔc/Δc小鼠上发现Erbin参与焦虑样行为的表达,并且其通过调节抑制性神经元的输入,进而影响锥体神经元的兴奋性,导致了焦虑样行为的出现。另外,我们发现在BLA区注射Erbin-shRNA病毒特异性敲除PV神经元Erbin蛋白后,小鼠表现出显著的焦虑样行为。由于ErbinΔc/Δc小鼠是一个全身突变而且并不是诱导表达的方式,所以我们建立了特异性表达在PV中间神经元上的病毒。首先,我们构建了Erbin基因shRNA干扰质粒。然后,我们通过PV-Cre的小鼠和loxp的病毒,限定Erbin-shRNA只在PV阳性的神经元上表达。我们把Erbin-shRNA病毒立体定位注射到PV-Cre的小鼠的BLA区,经过三个星期的术后恢复和病毒表达之后,我们检测了小鼠的焦虑样行为。发现BLA区PV阳性的中间神经元敲除Erbin的小鼠有显著的焦虑样行为。具体表现如下:高架十字迷宫实验中,Erbin-shRNA(BLA区PV阳性的中间神经元敲除Erbin)组小鼠相对于对照组的小鼠在开臂停留的时间显著缩短,同时期进入开臂的次数的百分比也显著少于对照组的小鼠,但是其运动距离没有显著的差异,说明两组小鼠的运动能力没有显著的差异。同时在开放场实验中Erbin-shRNA组的小鼠进入中央的探索时间也显著缩短,但是运动距离没有显著差异。以上两个实验表明Erbin-shRNA组的小鼠有显著的焦虑样行为。如前面所述,我们也发现Erbin-shRNA小鼠BLA区PV中间神经元的兴奋性输入的降低。同时我们也进一步检测了BLA区GABA神经元上的微兴奋性突触后电mEPSCs,实验结果显示Erbin-shRNA小鼠的]mEPSCs的幅度显著降低,而频率没有显著的变化,提示Erbin-shRNA小鼠BLA区PV神经元兴奋性突触后膜上的AMPA受体数量变少,这一结果与基因突变的小鼠一致。同样我们检测了Erbin-shRNA小鼠的BLA区锥体神经元的兴奋性,发现Erbin-shRNA小鼠BLA区的锥体神经元的兴奋性显著增加。通过对注入电流诱发动作电位的分析,我们发现Erbin-shRNA小鼠锥体神经元的兴奋性显著升高,具体表现为在相同电流刺激下动作电位的发放数目显著增加,而且诱发第一个动作电位时给予的电流刺激的大小显著降低。我们进一步分析发现Erbin-shRNA小鼠相对于对照组小鼠来说,其静息电位水平未见显著的变化,这个说明兴奋期的改变并不是由神经元本身的特性造成的。第二部分通过Erbin-shRNA病毒敲除PV神经元上的Erbin发现,Erbin通过调节PV神经元的兴奋性输入,继而影响锥体神经元的兴奋性参与焦虑样行为的表达。最后,我们在焦虑动物模型上,进一步确定Erbin对焦虑样行为的调控及其机制。首先用正常C57小鼠制作焦虑模型,焦虑模型上我们选择了常用的束缚模型,也就是把小鼠装进与其自身差不多的通风良好的小管中,使小鼠不能随意移动,并且保持2个小时。连续束缚3天,束缚完后的第二天进行高架实验检查。之后取出小鼠脑袋,并通过切片取出BLA和海马,提取总蛋白进行western blot检测。我们发现束缚完后,小鼠的BLA区的Erbin表达水平显著降低,但是海马组织的Erbin表达水平没有显著变化。同样,我们对焦虑的小鼠进行电生理检测,发现焦虑小鼠的BLA区的PV中间神经元的兴奋性输入明显降低,同时锥体神经元的兴奋性明显增加,通过BMI抑制GABAA受体后,锥体神经元的兴奋性增加被消除。Erbin对抑郁样行为的调节作用及其机制研究首先,我们检测了ErbinΔc/Δc突变小鼠的抑郁样行为,结果发现在糖水偏好实验(Sucrose preference test)中突变小鼠对糖水的偏好显著降低,社会交往实验(Social interaction test)中突变组小鼠交往时间显著降低,以及悬尾实验(Tail suspension test)中突变小鼠不动时间显著增加,三个不同抑郁模型的实验结果均表明ErbinΔc/Δc小鼠有显著的抑郁样行为。其次,根据以往的研究前额叶皮层跟抑郁的发病密切相关,而且前额叶皮层的mPFC区是调控抑郁发生的重要区域。我们检测了mPFC的锥体神经元的兴奋性。发现ErbinΔc/Δc小鼠锥体神经元的兴奋性显著升高,具体表现为在相同电流刺激下动作电位的发放数目显著增加,而且诱发第一个动作电位时给予的电流刺激的大小显著降低。在前面的实验我们发现ErbinΔc/Δc小鼠的mPFC区的锥体神经元的兴奋性显著增加,并且可能为锥体神经元的抑制性输入降低导致,在中枢神经系统GABA能系统是最主要的抑制性系统。而且GABA能系统对锥体神经元的兴奋性具有强大的调控作用,提示Erbin可能通过调节GABA传入调控锥体神经元的兴奋性。同时以往的研究也表明GABA能系统在抑郁调控中发挥重要的作用。因此,我们检测了Erbin对]mPFC区的GABA能系统是否有作用。通过对mPFC区锥体神经元上的GABA能突触传入的检测,发现ErbinΔc/Δc小鼠锥体神经元的自发抑制性突触后电流(spontanous inhibitory postsynaptic currents, sIPSCs)的频率显著降低,但幅度没有显著的变化。表明GABA功能的减弱导致了mPFC的锥体神经元的兴奋性水平增加,表明PV中间神经元的兴奋性输入降低导致的锥体神经元的兴奋性增加同样也是抑郁发病的重要因素。


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