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《南方医科大学》 2016年
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联合检测初治急性髓系白血病患者MDR1、BAALC基因表达及MDR1基因在诱导化疗中的价值

郭绪涛  
【摘要】:研究背景:急性白血病(Acute Luekemia, AL)是我国的十大恶性肿瘤之一,青少年和35岁以下成年人发病率最高的恶性肿瘤,其中急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是成人AL最常见的类型。近年来由于各种因素导致,AML的发病率呈明显上升趋势。AML患者发病后病情危重,且进展十分迅猛,如不及时治疗,早期死亡率高。如果得到规范化治疗,AML患者病情有望得到控制,甚至达到治愈的水平。近年来,随着对AML疾病特点及其发病机制等的认识愈加深入,个体化分层精准治疗等策略的提出明显提高AML治疗疗效。另外,随着新化疗药物的开发、应用,各种靶向治疗药物,以及对化疗方案的改进、支持治疗的加强及造血干细胞移植技术的广泛应用,AML的治疗效果已有明显改善,75%左右的初治AML患者首次诱导经疗后可获得完全缓解(CR),但仍有20%-30%AML病人经化疗不能获CR,称为难治性AML。此外,50%左右获CR的AML病人还会出现复发。难治和复发性AML患者,即使再进行标准化、规范化,甚至更加积极手段的治疗方式,其再次缓解率也比较低,总生存率及无病生存率低,预后较差。因此,难治和复发是目前导致AML治疗失败的最根本原因。目前国内外所制定难治白血病的诊断标准如下:(1)初治病人对常规诱导化疗无效;(2)在首次缓解6个月内即早期复发的白血病;(3)虽然在首次缓解6个月后复发,但以原方案再诱导治疗失败者;(4)第2次或2次以上的复发患者。以上几条标准均为临床治疗后的回顾性诊断,无法运用于指导临床分层治疗。如果能够在患者确诊为AML早期即能够判断其预后,建立起难治复发白血病早期诊断的方法,不仅可以早期预测难治复发,判断病人的预后;而且更重要的是能够指导临床治疗。对于高危病人可采用更加积极的治疗方案,如更早地选择异基因造血干细胞移植等,从而减少难治复发白血病发生率、提高AL治疗缓解率和长期生存率;而对于低危病人可以考虑选择较为保守的治疗方案,以减少患者治疗过程中所带来的治疗相关毒及,减少治疗相关死亡等风险,减少并发症带来的损害以及治疗费用,具有十分重要的意义。目前研究发现某些分子生物学以及细胞遗传学的异常与AML的发生、发展(也就是难治与复发)存在十分密切关系。如AML的FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)突变和ALL的BCR/ABL融合基因表达。目前已证实约20%~40%的AML患者中存在FLT3-ITD突变,而伴有FLT3-ITD突变的AML患者的预后较差,其总生存率及获CR率下降,复发率增多,可以做为AML患者早期诊断难治复发的分子指标;而在ALL中,约20%~30%ALL病人存在ph染色体,(即BCR/ABL融合基因的表达),而具有BCR/ABL融合基因阳性的ALL患者易出现难治复发,有研究者将之称为极高危组病人,其预后差,可作为早期诊断难治复发的分子指标,指导临床治疗[25-29]。而其他如ERG[30-33]. MN1[33-38]、EVI1[35,39-42]、IDH1/2[17,43-47]等基因的过表达是AML的预后判断指标,它们分别通过各种信号通路从促进白血病细胞增殖、抑制凋亡及阻断分化等各个环节影响AML的发生和发展。但70%-80%AML不存在FLT3/ITD突变。因此,寻找新的与难治复发AL相关的基因异常用于指导临床分层治疗显得十分迫切。最新研究提示MDR1基因及BAALC基因在AML患者中过度表达,且可能与难治复发AML相关。1、MDR1基因在AML中的作用MDRl是白血病化疗药物耐药的主要介质,可产生渗透性糖蛋白P-gap (MDR1基因编码蛋白)。MDR1基因的表达与细胞抑制类药物细胞骨保留有关,可通过P-gp将药物从细胞内转到细胞外,导致细胞内药物浓度下降,产生耐药;P-gp也可使细胞内的细胞器重新分布,从而使作用位点的药物浓度降低而导致耐药。另外,研究表达MDR1基因表达水平与白血病病人的治疗反应及生存相关。伊达比星(IDA)是一种新的蒽环类药物,国外有研究报道IA(伊达比星,IDA以及阿胞胞苷,Ara-C)方案诱导化疗的AML患者较DA(柔红素,DNR以及阿胞胞苷,Ara-C)方案疗效好;国外体外实验表明IDA能部分克服MDR1介导的耐药。2、BAALC基因在AML中的作用脑和急性白血病胞浆基因(Brain and acute leukemia cytoplasmic, BAALC)定位于染色体8q22.3,正常情况下,BAALC主要表达在神经外胚层来源组织和CD34+早期造血细胞,且随着造血细胞的分化,BAALC的表达逐渐下调,在成熟的骨髓细胞以及外周血白细胞不表达。最近研究发现BAALC基因仅在急性白血病(AL)及慢性粒细胞白血病急变的患者中高表达,而在慢性白血病患者不表达,表明BAALC基因与AL发生密切相关。国外多个大样本的研究及我们研究结果均表明BAALC过表达是正常核型的AML (CN-AML)患者一个独立的不良预后因素,BAALC高表达患者CR率低,无病生存(DFS)和总生存(OS)期明显缩短,且同化疗耐药、高的累积复发率及死亡的危险度密切相关。因此,BAALC基因与AML的难治复发关系密切。目前发现MDR1和BAALC基因的表达水平与AML的预后存在一定关系,且考虑到两者在AML发生、发展中的作用及其在不同AML患者中的表达水平的差异。有必要深入研究MDR1和BAALC基因在AML患者中的表达水平、明确两者的相关性及其与临床疗效和预后的关系,探讨联合定量检测MDR1和BAALC基因的表达水平在早期诊断难治AML及预后判断中的价值。在本研究中,我们构建了实时荧光定量PCR检测MDR1和BAALC基因mRNA表达量的方法,检测209例初治AML患者骨髓中MDR1和BAALC基因的表达水平,并对其与细胞形态学,细胞遗传学,免疫表型、临床特征、临床疗效及预后的关系进行了分析。另外,进一步分析MDR1高、低表达组AML患者使用IA和DA方案两种诱导治疗方案的缓解情况,研究IDA是否能够提高MDR1水平高表达AML患者的缓解情况。目的:1、构建实时荧光定量PCR检测MDR1和BAALC基因的方法;2、检测初治AML患者中MDR1和BAALC基因的表达水平及不同FAB亚型患者中两基因表达水平的差异。3、探讨AML患者在染色体核型、临床特征及免疫表型与MDR1和BAALC mRNA表达水平的关系;4、分析MDR1和BAALC基因两者表达水平之间的关系及其与AML疗效和预后的关系。5、明确IA与DA方案在AML患者诱导缓解中的作用及其与MDR1表达的关系。方法:1、培养KASUMI-1细胞,提取总RNA,以GAPDH为内参基因,针对MDR1和BAALC及GAPDH基因的mRNA设计引物,PCR扩增目标序列片段,PCR产物纯化后转化到T载体,构建含目标序列片段的质粒,做为阳性定量标准模板的克隆。2、克隆的阳性定量标准模板按106,105,104,103,102,101 copies/μl进行梯度稀释,在荧光定量PCR仪分别进行PCR反应,得出标准曲线并验证该本实验方法的灵敏性和重复性,同时验证MDR1和BAALC, GAPDH三者扩增效率是否达到一致。3、研究对象:经MICMi[细胞形态学及组织化学染色、免疫分型、细胞遗传学以及分子生物学)确诊的209例初治AML患者以及30例非恶性血液病患者的骨髓标本。4、收集AML患者骨髓标本,分离单个核细胞后提取总RNA,逆转录PCR方法逆转录为cDNA,进行Real Time PCR检测。每份标本均进行3次重复检测,每次进行3个复孔检测,经PCR仪器获得CT值并取其均数。为排除RNA浓度差异对扩增效率的影响,MDRl和BAALC mRNA表达水平采用相对表达量来表示,即采用2-ACT值(ACT=MDR1 或 BAALC-GAPDH;2-ΔCT=2GAPDH-MDR1 或BAALC)来表示MDR1和BAALC的相对表达量;分析MDR1和BAALC表达水平与AML患者的性别、年龄、FAB分型、染色体核型、临床特征、疗效和预后之间的关系,并分析其临床意义。5、209例AML患者中有189例分析选择了伊达比星(即去甲氧柔红霉素)联合阿糖胞苷或柔红霉素联合阿糖胞苷方案进行诱导缓解的患者。分析两种不同治疗方案中的治疗缓解率并分析其与MDR1表达之间的关系。诊断和疗效标准参照张之南主编的《血液病诊断与疗效标准》。6、统计学:利用SPSS 19.0软件统计分析数据。两组计量资料间分布比较用Mann-whitney U test;两组以上计量资料间分布比较用Kruskal-wallis test及Bonferroni test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation test;率的比较采用卡方检验;生存分析采用Kaplan Meier analyses,不同生存曲线间差异采用log-rank test。生存时间的单因素和多因素分析使用Cox Regression。所有检验以P0.05为显著统计学差异,双侧检验。结果:1、利用Trizol提取的KASUMI-1细胞的总RNA,经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见28S和18S明显的2条条带,证明抽提的总RNA质量完好,无DNA污染。RT-PCR扩增后终产物经2%琼脂糖凝胶电泳,可看到与目的片段大小一致的62bp (MDR1)、60bp (BAALC)及225bp (GAPDH)的电泳条带。2、不同浓度梯度标准品模板的对数值与荧光定量PCR扩增的循环数(CT值)之间有着非常好的线性相关关系(r=0.997,0.996,0.997)。本实验所构建的体系之灵敏度可达10拷贝/μ1,重复性良好。MDR1和BAALC, GAPDH三者扩增曲线的斜率分别为-3.213、-3.208、-3.251;扩增效率分别为97%,96%,97%,说明三者扩增效率基本一致。3、209例AML骨髓标本中MDR1基因表达量中位数为0.016(0~19.525),BAALC基因表达量中位数为0.043(0~12.148);而30例非恶性血液病患者骨髓标本中MDR1基因表达量中位数为0.005(0~0.098),BAALC基因表达量中位数为0.004(0.001-0.013)。AML患者组中MDR1基因及BAALC基因表达均显著高于正常对照组(P值均为0.000)。4、AML患者中MDR1和BAALC基因表达水平与AML患者的年龄、性别、FAB分型、外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及染色体核型之间的异常均无统计学差异(P值均0.05)。5、209例中有189例AML患者使用伊达比星或柔红霉素联合阿糖胞苷方案(标准3+7方案)进行诱导缓解治疗。其中有20例(MDS相关AML 12例,老年白血病8例)选择其他方案进行化疗,包括含或不含有地西他滨的CAG方案。6、209例患者中首次诱导化疗后CR率为72.2%(152/209),而根据核型进行危险分层,92例中危AML中首次诱导化疗后CR率为79.3%(73/92)。中危AML中复发率为39.7%(29/73)。根据MDR1和BAALC基因表达情况,将209例患者分为4组。MDR1基因和BAALC基因均高表达组、MDR1基因高表达而BAALC基因低表达组、MDR1基因低表达而BAALC基因高表达组、MDR1基因和BAALC基因均低表达组。后三组间病人的一般情况及预后资料之间无统计学差异,因此将后组合并为一个组,即MDR1和/或BAALC基因高表达组。中危组AML中低MDR1/低BAALC患者的CR率(93.3% vs 72.6%,P=0.021)和OS (50.3% vs 178%,P=0.001)明显高于MDR1和/或BAALC基因高表达组,而复发率明显低于MDR1和/或BAALC基因高表达组(7.1% vs.42.5%,P=0.000)。与核型预后良好组AML相比,中危核型AML中低MDR1/低BAALC基因表达的患者的CR率(93.3%vs85.7%P=0.341)、复发率(7.1% vs.8.8%,P=0.514)以及OS(50.3% vs 63.1%,P=0.431)之间的差异无统计学异常。单因素分析结果提示,MDRl和/或BAALC基因高表达(P=0.019)与WBC (P=0.002)是OS的预后不良因素。7、分析189例使用IA或DA方案进行诱导缓解化疗的AML患者的临床资料。结果提示189例初治AML患者获完全缓解的有130例,即CR率为68.8%;以MDR1表达水平的中位数为中界点,分为高MDR1表达组94例;低MDR1表达总例数为95例。其中IA方案诱导化疗组92例,而DA方案诱导组有97例。IA方案化疗后获CR者有76例,CR率为82.6%;而DA方案诱导组获CR者有54例,CR率为55.8%。IA方案组的CR率明显高于DA方案组(P=0.000)。而在高MDR1表达组中,其CR率为56/94(59.6%);而低MDR1表达组CR率为74/95(77.9%);高MDR1表达组CR率明显低于低MDR1表达组(P=0.007)。在不同细胞遗传学分层中比较发现,低危组及中危型AML患者中IA方案组的CR率显著高于DA方案组(低危组P=0.022;中危组P=0.008),而高危组及未检测出核型AML患者中2组方案的CR率差异均无统计学意义(P均大于0.05)。进一步分析发现在预后良好和中危核型组间,高MDR1表达AML患者中IA方案治疗组的CR率明显高于DA方案治疗组(低危组P=0.037;中危组P=0.001),而在MDR1表达AML患者中IA和DA方案治疗组间的CR率无明显统计学差异(预后良好P=1;中危核型组P=0.082)。而在高危组及未检测出核型组间,不管MDR1表达高低,IA和DA方案治疗组间的CR率均无统计学差异(P值均大于0.05)结论:1、成功构建了荧光定量PCR检测MDR1和BAALC mRNA表达水平的方法。2、AML患者MDRl和BAALC基因表达水平显著高于非恶性血液病患者,AML中MDR1基因表达水平与BAALC基因表达水平未存在相关性。3、AML中MDR1、BAALC基因表达水平与AML的年龄、性别、FAB分型、外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及染色体核型之间的异常均无统计学差异(P0.05)。4、联合检测MDR1和BAALC基因表达有助于提高成人AML中危核型组间治疗策略的调整。低MDR1/低BAALC的AML患者预后较好。5、IA方案对初治AML患者诱导治疗的CR率优于DA方案,主要是通过提高低中危AML患者的CR率实现的;克服MDR1高表达对初治AML患者CR率的影响很可能也是IA方案诱导治疗CR率高于DA方案的重要因素。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R733.71

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