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《南方医科大学》 2016年
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体内诱导iPS细胞向胸腺上皮细胞分化的研究

吴翠玲  
【摘要】:背景:干细胞(stem cell)是一种保留自我更新和多向分化潜能的原始且未特化的细胞群体,既可以通过细胞分裂的方式不断增殖维持自身群体的大小,又可以在特定的条件下分化形成不同的组织细胞。干细胞依分化潜能分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和专能干细胞(unipotent stem cell)三类。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是受精卵发育到囊胚阶段时,内细胞团(inner cell mass, ICM)中的细胞。胚胎干细胞因其全能分化能力而在器官移植、细胞替代治疗和基因治疗等方面具有广阔的应用前景,但胚胎干细胞研究存在的伦理学争议、免疫排斥、来源有限等问题又极大地限制了它的发展和临床应用。因此,科学家也积极寻求替代胚胎干细胞的途径,试图经过重编程的方法诱导已分化的体细胞转化为干细胞。重编程(reprogramming),是指已分化的细胞恢复其分化前的功能状态的过程。细胞重编程的方法包括核移植、体细胞与胚胎干细胞的细胞融合及诱导性多能干细胞技术。细胞核移植技术就是将供体细胞核移入同种或异种去核的卵母细胞中,使已分化的体细胞核恢复全能性的技术。细胞核移植技术具有里程碑意义的事件是1997年克隆羊多莉的诞生,研究者利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞,通过核移植克隆获得一只雌性绵羊。已分化的体细胞可以被重编程恢复全能性进而发育为完整个体,这说明终末分化的体细胞仍然具有分化发育为一个个体所需的全套遗传物质,在适当的条件下可以被重新激活。细胞融合是在自然条件或人工诱导下,两个或以上的细胞合并形成一个整体的过程。研究者发现将终末分化的细胞与胚胎干细胞融合,也能诱导体细胞重编程。但是,杂交细胞在进行细胞分裂的过程中会发生核融合、染色体的丢失和重排等异常,这些都限制了细胞融合技术的临床应用。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术就是通过在已分化的体细胞中过表达某些特定的关键转录因子,诱导体细胞重编程获得多能干细胞的技术。这种干细胞在形态学、生长特性、基因表达、畸胎瘤形成及嵌合体形成等方面都与胚胎干细胞非常相似。诱导性多能干细胞技术不但克服了传统多能干细胞研究在伦理学方面的障碍,还具有来源广泛、相对容易获得、能得到个体或疾病特异的多能干细胞等优点。许多学者致力于诱导iPS细胞定向分化的研究,已成功将iPS细胞诱导为神经元、造血祖细胞、胰岛β细胞、血管内皮细胞、肌细胞等。胸腺是体内的中枢性免疫器官,提供复杂的微环境调节T细胞的存活、分化、选择和迁移,是T淋巴细胞发育、分化、成熟的场所,也是自身免疫耐受的中心。胸腺上皮细胞(thvmic epithelial cells, TECs)是胸腺微环境最重要的组分,皮质上皮细胞通过阳性选择过程,使T细胞获得主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性抗原识别能力,而髓质上皮细胞则通过阴性选择清除自身反应性T细胞,从而诱导对自身抗原的耐受性。近年来,有关胸腺移植用于诱导移植物耐受的研究越来越受到重视。相关的研究发现胸腺在诱导快速稳定的免疫耐受形成过程中有重要的作用,且胸腺联合移植能诱导受者对异种移植物的免疫耐受。Miyake等发现接受胸腺移植联合骨髓移植的小鼠,移植后T淋巴细胞的功能恢复了正常,增强了移植物抗肿瘤效应(graft-versus-tumour, GVT)的同时,却不会发生严重的移植物抗宿主反应(graft versus host reaction reaction,GVHR)。胸腺移植在诱导移植耐受方面显示出诱人的应用前景。但是迄今为止,移植所用胸腺都是来自于流产胎儿或是先天性心脏病患儿手术时切除的胸腺,而且存在人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)不匹配导致的移植排斥问题,胸腺的来源困难也制约了胸腺移植技术的广泛开展。诱导性多能干细胞技术的突破,为解决胸腺来源有限及免疫排斥等难题提供了新的契机。许多报道已证实ES细胞能通过体外或体内诱导分化的方法获得胸腺上皮细胞。有学者通过利用某些因子调控干细胞内胸腺发育相关的WNT、BMP、RA等信号通路,成功诱导ES细胞分化为胸腺上皮祖细胞或胸腺上皮祖细胞样细胞,这些细胞移植入动物体内后能促进宿主的T淋巴细胞重建。但这种体外诱导的方法诱导环境成分复杂,诱导效率较低,而且细胞的分化水平难以鉴别,将未分化或不完全分化的干细胞移植入体内有导致畸胎瘤的可能。2011年,Isotani等通过囊胚注射构建嵌合体的策略成功诱导ES细胞分化为胸腺组织。这种体内诱导分化的方法经历细胞的正常分化进程,不需使用多种外源性因子,减少了细胞水平的长期而复杂的操作,所获得的组织细胞的安全性和稳定性较高。然而,无论是体外或是体内诱导分化的方式,国际上尚未见iPS细胞用于胸腺上皮再生的研究报道。研究目的:探讨一种iPS体内诱导分化为胸腺上皮细胞的方法。将表达绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6小鼠的iPS细胞,通过显微注射的方法,注射到ICR小鼠胚胎的囊胚腔内,构建iPS细胞嵌合体,再从嵌合子代中获得iPS细胞来源的胸腺上皮细胞,并鉴定iPS来源的胸腺上皮细胞的功能。为iPS细胞定向分化的研究及临床应用奠定实验基础。研究方法:1.iPS细胞的培养:iPS细胞培养于预先铺有丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上,在37℃、5%C02、饱和湿度的条件下培养,每日换液,每3d传代1次。按照1:3到1:8的比例进行传代。用于囊胚注射的iPS细胞在注射前两日传代,注射当天用差速贴壁法去除MEF细胞,将消化成单细胞的iPS细胞悬浮于培养基中,冰浴备用。2.分离获得ICR小鼠囊胚:6-8周龄的雌性ICR小鼠,腹腔注射孕马血清促性腺激素及人绒毛膜促性腺激素刺激超数排卵,并与育龄公鼠合笼。E3.5即交配后第四天上午处死雌鼠,取出子宫,冲胚获得胚胎。3.iPS细胞囊胚注射:将表达绿色荧光蛋白(GFP)的iPS细胞,通过显微注射的方法,注射到ICR小鼠E3.5胚胎的囊胚腔内,每个囊胚注射10-15个iPS细胞,获得嵌合胚胎。4.将嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宫内,后代在出生后10天左右可通过毛色判定嵌合情况;5.分离嵌合小鼠的胸腺,进行石蜡切片HE染色、免疫组织化学染色及冰冻切片,观察嵌合体胸腺的形态学特征。6.鉴定嵌合体胸腺的功能:将嵌合小鼠的胸腺移植到BALB/c裸小鼠的肾被膜下。移植后4周处死小鼠,取脾脏制成单细胞悬液,以抗小鼠PE-CD3、FITC-CD4、 APC-CD8单抗染色后流式细胞仪分析检查CD4、CD8比例,分析受体小鼠T淋巴细胞重建情况。研究结果:1.成功构建小鼠iPS细胞嵌合体:我们用GFP阳性的小鼠iPS细胞系构建嵌合体,然后将嵌合胚胎移植到假孕雌性小鼠的子宫内。共移植胚胎363枚,移植后受孕的代孕母鼠在妊娠第17天左右自然分娩,获得幼崽56只,其中13只为嵌合体。从小鼠的被毛颜色评估,组成小鼠iPS嵌合体的细胞中,GFP小鼠细胞所占的比例从5%到90%不等。2.嵌合体胸腺的形态特征:组织学观察显示,嵌合体胸腺有典型的胸腺皮质和髓质结构。冰冻切片,荧光显微镜观察可见嵌合体胸腺表达绿色荧光蛋白。免疫组化检测,以K8和K5单抗染色,显微镜观察,可见K8+的皮质上皮细胞、K5+的髓质上皮细胞。3.iPS嵌合体的胸腺促进受体T细胞重建:为了分析iPS嵌合体所形成的胸腺是否有功能,我们把胸腺移植到裸小鼠的肾被膜下。移植前,这些小鼠体内无CD4或CD8单阳性细胞(CD3阳性),移植后6周,受体小鼠体内出现了CD4+CD8-及CD4-CD8+细胞。结论:1.通过囊胚注射构建嵌合体的体内诱导的方法可获得iPS来源胸腺上皮细胞。2.iPS细胞来源的胸腺上皮细胞能促进受体T淋巴细胞分化发育。3.体内诱导分化获得iPS来源的胸腺上皮细胞移植后能在受者体内能形成正常的胸腺结构。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R329.2

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