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《南方医科大学》 2017年
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Stathmin通过Shh信号通路调控人牙髓干细胞增殖与成骨/成牙向分化机制的研究

于海悦  
【摘要】:研究背景和目的牙髓干细胞被认为是牙齿再生工程的关键细胞之一,当牙齿受到龋损、磨损、外伤等刺激时,牙髓内的牙髓干细胞被激活并诱导分化为成牙本质样细胞,形成修复性牙本质从而阻止病变进展保存牙髓活力。牙髓组织的这种修复潜能为研究牙髓牙本质复合体再生提供了可靠的生物学基础。因此,深入了解牙髓干细胞的成牙本质向分化机制,寻找参与过程的关键分子对于形成生理性牙髓牙本质复合体与构建组织工程牙齿具有重要意义。微管蛋白Stathmin是本研究团队前期筛选出的在正常和深龋牙髓干细胞中表达存在差异的蛋白,与骨组织矿化关系密切。Sonic hedgehog(Shh)作为调节牙齿发育的经典信号通路,在牙髓干细胞成牙本质向分化及增殖中发挥重要作用。目前尚未有研究报道Stathmin在人牙髓干细胞增殖与成牙本质向分化中发挥的作用及作用机制,本研究旨在明确Stathmin在调节人牙髓干细胞的增殖与成骨/成牙向分化中发挥的作用,探究Shh信号通路是否参与Stathmin对人牙髓干细胞增殖与成骨/成牙向分化的调控。材料与方法采用原代组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,并对其表面分子标志物与多向分化潜能进行鉴定。利用细胞免疫荧光确定Stathmin在人牙髓干细胞的定位,利用慢病毒载体构建抑制Stathmin表达的细胞模型,Realtime PCR与Western blot检测抑制Stathmin表达后人牙髓干细胞增殖与成骨/成牙向分化的改变及Shh与其下游信号分子的表达变化。CCK8法与流式细胞术检测人牙髓干细胞增殖能力与细胞周期的改变。Realtime PCR与Western blot检测在抑制Stathmin表达的人牙髓干细胞内加入激活剂purmorphamine后Shh信号通路激活效率与人牙髓干细胞成骨/成牙向分化及增殖能力的改变。结果本实验成功分离培养出人牙髓干细胞,流式细胞检测细胞表面间充质干细胞分子标志物CD29、CD44、CD90、CD105阳性表达率分别为99.84%、99.82%、99.72%、100%;造血干细胞分子标志物CD31、CD45阳性表达率分别为0.07%、0.23%。细胞具有成骨、成脂、成软骨多向分化潜能。细胞免疫荧光结果显示Stathmin主要表达于人牙髓干细胞细胞质和细胞膜内。通过Realtime PCR、Western blot验证成功构建shRNA-Stathmin慢病毒载体;shRNA-Stathmin组矿化诱导14d后矿化结节生成能力与ALP、BSP、OCN、DSPPmRNA表达量较shRNA-Ctr1组明显降低;CCK8法与流式细胞术测得shRNA-Stathmin组细胞增殖能力较shRNA-Ctrl组明显降低。shRNA-Stathmin组Shh及其下游信号通路分子PTCH1、SMO、GLI1mRNA与蛋白表达量较shRNA-Ctr1组明显降低。在shRNA-Stathmin组人牙髓干细胞中加入激活剂purmorphamine后激活Shh信号通路,Realtime PCR、Western blot检测shANA-Stathmin+PM组PTCH1、SMO、GLI1表达量较shRNA-Stathmin组显著增加。shRNA-Stathmin+PM组矿化诱导14d后成骨/成牙向分化相关基因ALP、BSP、OCN、DSPPmRNA表达量较shRNA-Stathmin组明显升高;CCK8法与流式细胞术测得shRNA-Stathmin+PM组细胞增殖能力较shRNA-Stathmin组明显增加。结论本实验在体外成功分离培养人牙髓干细胞,经鉴定为间充质来源,且具有克隆形成能力及成骨、成脂、成软骨多向分化能力。Stathmin对于维持人牙髓干细胞增殖与成骨/成牙向分化有正向调控作用。Stathmin可能通过参与Shh信号通路调节人牙髓干细胞的增殖与成骨/成牙向分化。
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