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SVF-gel:一种高浓度脂肪来源干细胞基质胶的实验研究及临床应用

姚尧  
【摘要】:研究背景和目的当前脂肪来源干细胞(ASCs)的应用已经扩展至临床诸多领域,最为盛行的是应用于整形外科领域的脂肪移植,然而,该法却始终面临着一些临床应用的困境,例如分离流程复杂、需要引入外源的、异种的酶蛋白消化组织等等。传统的化学消化法所分离获得基质血管片段(SVF)为细胞悬液,并非黏附在细胞外基质(ECM)上的生理状态,所以移植后ASCs易被宿主巨噬细胞吞噬,使成熟脂肪细胞和ASCs均不能长久成活,这是导致脂肪移植保留率不稳定的主要原因。2013年纳米脂肪(Nanofat)的问世给了我们很大的启示,该法是通过物理方法将脂肪组织处理成一种近似干细胞悬液的状态,以此进行真皮内注射,达到干细胞疗法的效果。虽然Nanofat选择性破坏了脂肪细胞,达到了可通过锐针注射的目的,但由于其含有大量肿胀液及脂滴成分,最主要的SVF细胞浓度甚至低于普通脂肪组织,因此无法达到干细胞疗法的要求。能否通过纯物理手段获取高浓度SVF/ASC细胞的同时,又最大程度获得起保护作用的ECM呢?故本研究目的在于通过对Nanofat进一步的处理,提取一种富集SVF细胞和ECM的高浓度产物,以提高脂肪移植的成活率和稳定性,特命名为脂肪来源干细胞基质胶ECM/SVF-gel。实验分为以下几个方面:1)ECM/SVF-gel的定义及标准制备流程的确定;2)ECM/SVF-gel中各细胞亚群成分分析;3)ECM/SVF-gel作为干细胞疗法促进创伤修复的实验研究;4)ECM/SVF-gel作为高保留率的组织移植材料,移植后的结构变化;5)ECM/SVF-gel的临床应用。方法与实验结果将抽吸获得的脂肪组织进行不同时间的机械力处理、去油,实验结果显示所获得的ECM/SVF-gel,在处理1分钟后,体积基本稳定,脂肪组织的脱油率在85%至90%。我们将脂肪组织从抽吸到制成Nanofat再到ECM/SVF-gel,制定出标准化流程,其中运用流体涡旋以及絮凝沉淀的物理学原理,最终获得ECM/SVF-gel的浓缩脂肪组织。ECM/SVF-gel呈胶冻状,可通过27g锐针进行皮内注射,与脂肪抽吸物相比质地更为均匀。ECM/SVF-gel的电镜观察,可见其中含有大量的ECM成分,并且短时间内随着物理处理时间的延长,ECM结构基本保持完整。免疫荧光共聚焦结果以及流式细胞分析结果显示,ECM/SVF-gel与正常脂肪组织以及Nanofat相比,去除了绝大多数的成熟脂肪细胞和油脂,保留大量的血管片段、细胞外基质,SVF细胞数量达到了正常脂肪组织的4~5倍,而CD34+细胞达到了处理前的6倍。将提取的SVF细胞贴壁培养,进行成脂、成骨以及成软骨分化诱导,结果显示,物理处理后存活的干细胞并未受到机械力的影响,依然具有多向分化能力。将ECM/SVF-gel应用于动物创面愈合模型,实验结果显示,较单纯注射SVF组,ECM/SVF-gel对促进创面愈合作用更加明显。将新鲜制备的hECM/SVF-gel移植至裸鼠背部皮下,在移植后两周、四周以及更长的3个月时间点观察,ECM/SVF-gel移植后保留率非常稳定,远期保留率高于80%。移植物组织切片观察,ECM/SVF-gel移植后组织内空洞及坏死组织明显少于普通脂肪移植组。移植后14天,组织内出现大量小细胞,并在移植一个月后即可观察到均一的脂肪细胞,而普通脂肪移植后则出现明显组织坏死、纤维化结构以及较大空泡。同步进行的临床试验结果显示,ECM/SVF-gel对于颈部皱纹、面部凹陷以及局部皮肤色素沉着等衰老性表现的治疗作用十分显著。结论1、ECM/SVF-gel是自体脂肪组织经纯物理方法处理后获得的、由高浓度生物活性细胞外基质ECM、脂肪来源干细胞ASCs构成的、可注射的凝胶状脂肪移植材料。2、按照本课题组制定的标准流程制备出的ECM/SVF-gel中,SVF细胞仍处于粘附在ECM上的正常生理状态,二者均保留了相对完整性和生物活性。3、ECM/SVF-gel促进创伤愈合的作用优于SVF细胞悬液,其在干细胞疗法领域的应用前景广阔。4、ECM/SVF-gel移植后的成活/再生模式异于普通脂肪组织,可显著提高其远期保留率。5、ECM/SVF-gel制备简单、使用安全,符合当前政策法规对于临床进行组织/细胞移植的要求,经初步临床观察,在干细胞疗法和组织移植应用方面均明显优于传统方法,具有广泛的临床应用前景,值得深入研究和推广应用。


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