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《南方医科大学》 2018年
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重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达及纯化

邓东灵  
【摘要】:胱天蛋白酶募集域蛋白 9(caspase recruitment domain-containing protein 9,CARD9)是一个参与信号传导的重要衔接蛋白,定位于染色体9q34.3,cDNA全长为2108 bp,编码536个氨基酸残基,表达相对分子质量约为62.3 kDa的蛋白质。CARD9能结合Bcl 10和MALT 1从而形成CBM复合体,连接模式识别受体,产生相应的免疫反应来抵抗真菌、细菌及病毒的入侵。MBP由大肠杆菌ma1E基因编码,是细菌麦芽糖转运系统的成员之一,主要在大肠杆菌中参与麦芽糖的摄取和分解代谢。MBP由371个氨基酸残基组成,其分子量大小约为42 kDa,MBP标签主要用于促进蛋白质的溶解性,具有促溶范围广、促溶效率高、且易于纯化等优点,可增加细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核细胞蛋白质。此外,MBP标签可增加目的蛋白的稳定性,与MBP标签分离后,目的蛋白很容易恢复其天然构象。鉴于CARD9在先天性免疫反应方面中扮演的重要角色,解析其蛋白结构进而阐明其功能显得格外重要。迄今,有关CARD9的研究,主要集中在体内免疫和动物实验等方面,而关于其本身蛋白结构的研究暂未见到发表。所以本课题试图通过构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,并尝试表达和纯化,以期为进一步的研究奠定实验基础。目的:构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化。方法:利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者通过酶切连接的方法正确插入pET-30a(+)载体中得到重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,后进行PCR和酶切鉴定以及基因测序。将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SD S-PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9-MBP融合蛋白进行纯化,并尝试用HRV3C蛋白酶过夜酶切去除M BP标签。结果:成功构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致。SDS-PAGE电泳显示,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约为105 000的目的蛋白。通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后,可得到相对较纯的融合目的蛋白,经过HRV3C蛋白酶过夜酶切去除MBP标签后,CARD9蛋白主要存在于沉淀中。后期将初步纯化的蛋白混合液合并浓缩,通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9-MBP融合蛋白。结论:成功构建了重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,并进行了大量可溶性表达。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化,可得到较纯的目的蛋白。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q51

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