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《南方医科大学》 2018年
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脂肪来源干细胞基质胶促进缺血皮瓣成活的实验研究

张攀  
【摘要】:研究背景和目的随着高血压、糖尿病、肿瘤等疾病发病率的增加,以及各类外伤和自然灾害频繁发生,临床上经常遇到各种类型的难愈创面或者大面积组织缺损。覆盖及修复受损组织是整形科修复重建领域常见病种之一。而皮瓣则是修复重建领域最常用到的修复手段之一,尤其以技术要求简单的随意皮瓣最为常用,而皮瓣的坏死是困扰整形外科医生的难题。虽然有各种预防和治疗皮瓣坏死的治疗手段,例如抗血管痉挛药物、局部物理治疗及高压氧治疗等,仍无法完全避免皮瓣坏死的发生及发展。再生医学技术的研究成果,为组织或器官的损伤或缺损修复重建研究提供了崭新的治疗方法和可能性,逐渐成为现在最前沿和最具潜力的生理性修复技术之一。间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞。其具有取材容易、具有多向分化能力、且其免疫原性低、存储量大等特点,间充质干细胞逐渐成为目前再生医学领域和组织工程化研究领域中最理想的种子细胞之一。Zuk等从抽脂术后废弃的脂肪组织中分离得到一类与骨髓间充质干细胞生物学特性十分相似的干细胞,随后这一类细胞被命名为脂肪间充质干细胞(ADSCsAdipose-derived stem cells)。与骨髓间充质干细胞相似,ADSCs 同样具有多向分化潜能,在不同条件培养基的诱导下,ADSCs可以分化为多种成体细胞,如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞和内皮细胞等。因为脂肪来源的间充质干细胞具有含量多,分离相对容易,能够避免伦理学问题等众多优点,逐渐成为相关领域专家学者研究的重点。但是由于ADSCS的获取需要经过细胞培养,对于临床应用来说周期相对较长。随后人们发现富含ASCs的血管基质片段(stromal vascular fraction,SVF)细胞,但是SVF细胞群获取中经历了加入胶原酶消化这一必不可少的操作。SVF细胞的分离需要用胶原酶消化30分钟至1小时,这将导致外源性物质在制备过程中可能发生的外源性污染;而且异种蛋白带来的生物污染也是不容忽视的。另外,ASCs的贴壁培养和纯化需要特定的实验室设备和操作人员丰富的操作经验,并且可能需要数天至数周,这将导致大多数缺血性疾病无法得到及时的治疗。从而给临床应用带来生物安全方面及时效性的困扰。所以造成了所有的研究大多数停留在实验室,而没有办法应用到临床治疗中。本实验室前期发表在PRS上面的文章提出一种我们提出的脂肪组织提取物,我们将其命名为SVF-gel,这种脂肪组织提取物起到了明显的浓缩脂肪干细胞的作用,其中含有脂肪干细胞的浓度达到了 10的五次方,能满足细胞疗法对细胞数量的满足。而且相比较单纯的SVF和ADSC来说,SVF-gel富含ECM,这种由ECM包裹细胞的组织结构可能更利于脂肪干细胞能够进入体内之后的存活过程。因为ECM相当于形成了一个细胞龛,我们推测这种细胞龛样结构可以保护细胞移植之后减少巨噬细胞对于细胞的吞噬作用,从而使得脂肪干细胞能够存活在移植区域发挥更持久的细胞疗法作用。方法与实验结果实验共分为三组,处理因素分别为人SVF-gel,SVF细胞悬液,生理盐水,(n= 10),在裸鼠背部皮瓣手术后即刻对皮瓣进行注射,随后的观察坏死和血管形成情况。通过Masson三色染色和免疫荧光等方法检测皮瓣的皮肤健康情况和新生血管。采用组织定量qRT-PCR进行检测促血管相关细胞因子VEGF和bFGF。最后,我们用免疫荧光追踪移植到裸鼠的人体组织。与盐水对照组(53.78%±0.1412)和 SVF 处理组(35.54%±0.0850,P = 0.039)相比,SVF-gel处理的皮瓣的坏死区最小(22.05%±0.0438)。SVF-gel移植物周围形成许多功能性肌皮穿支。SVF-gel处理皮肤脂肪组织恢复最好(231.3±48.1 μm)(F= 10.83,p = 0.0102),而盐水处理皮瓣远端出现纤维化。与生理盐水处理的对照相比,经SVF-gel处理的皮瓣也具有43%以上的CD31+毛细血管(p = 0.0152),VEGF和bFGF的血管生成细胞因子的基因表达增多(p值分别为0.0310和0.0303)。此外,我们发现hSVF-gel细胞(hGolgi +)能直接作为血管成分(α-平滑肌肌动蛋白,α-SMA+)参与到皮瓣血管新生过程中。结论脂肪组织来源干细胞基质胶中的细胞成分可能通过与皮瓣新生血管的部分直接结合,改善皮瓣存活和促成更健康的皮瓣组织。使用SVF-gel选择性脂肪移植表现出与干细胞疗法相当的功效,并且对于临床应用有巨大前景和价值。
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