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昼夜节律蛋白CRY1抑制紫杉醇诱导的膀胱癌细胞衰老

贾敏  
【摘要】:研究背景膀胱癌(Bladder cancer,BC)是最常见的泌尿道肿瘤,发病率和死亡率逐年上升。BC一线治疗是含顺铂(Cisplatin)的联合化疗,如GC(吉西他滨和顺铂)或MVAC(甲氨蝶呤、长春碱、阿霉素和顺铂)。对于转移性BC,紫杉醇(Paclitaxel,PTX)联合放疗或吉西他滨可作为二线治疗方案。但遗憾的是,相当一部分患者会对上述治疗方案耐药而复发。因此,增强膀胱癌细胞对药物的敏感性、逆转耐药具有重大的临床意义。细胞衰老(Cellular Senescence)是细胞在应激状态下进入不可逆细胞周期停滞的状态。根据诱发因素的不同,细胞衰老可分为复制性衰老、癌基因诱导的衰老、以及治疗诱导的衰老(Therapy-induced Senescence,TIS)。其中,TIS在肿瘤治疗中的作用逐渐受到关注,首先多种抗肿瘤药物(包括紫杉醇)可诱导细胞衰老发挥抗肿瘤活性。其次,TIS 可作为一种备用策略杀伤凋亡抵抗的肿瘤细胞。但是,TIS在膀胱癌治疗中的研究较少,而针对耐药膀胱癌的研究尚未见报道。昼夜节律(Circadian rhythm)是机体长期适应外界环境变化所产生的内在机制,调节许多重要的生理和生化过程,包括细胞增殖和衰老。昼夜节律的紊乱会增加人类患癌症的风险,但是,四个核心时钟基因对肿瘤的影响仍然是有争议的,特别是,昼夜节律与肿瘤耐药性之间的关系仍未阐明。研究目的1.明确膀胱癌耐药细胞是否抵抗治疗诱导的衰老;2.明确膀胱癌耐药细胞中昼夜节律特点;3.探究时钟基因在膀胱癌耐药细胞抗衰老中的作用机制。研究方法和结果1.建立顺铂耐药膀胱癌细胞系(CRBC)顺铂(4μg/ml)长期处理膀胱癌UMUC3、EJ细胞,MTS结果显示筛选所获细胞不但耐受顺铂杀伤,而且对紫杉醇也表现出高度耐受,Real-time PCR结果显示多药耐药基因表达显著增高,表明细胞获得多药耐药特性。2.CRBC在PTX作用下进入静止期且抵抗衰老PTX处理膀胱癌细胞后,细胞阻滞在G2/M期,细胞核呈多倍体表型,这与PTX抑制有丝分裂的活性相符。但PTX处理CRBC后,细胞阻滞在G0/G1期,未呈现核多倍体,EdU检测显示DNA复制明显减弱,增殖相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和MCM7表达显著降低,这说明CRBC在PTX作用下直接进入相对静止的状态。PTX处理膀胱癌细胞后,半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色细胞明显增多,P53、P21蛋白表达升高,但PTX处理CRBC后,上述衰老相关表型均不显著,这说明PTX可诱导膀胱癌细胞衰老,但CRBC抵抗紫杉醇诱导的衰老。3.衰老抵抗CRBC中昼夜节律延长且CRY1累积Real-time PCR和Western blot检测结果显示,衰老抵抗的CRBC在PTX作用下昼夜节律周期延长,振幅增大,昼夜节律蛋白BMAL1、CLOCK和PER2水平降低,而CRY1蛋白水平显著增高。4.CRY1通过促进P53降解介导CRBC衰老抵抗采用RNAi抑制CRY1后,PTX作用下CRBC中SA-β-Gal染色细胞明显增多,P53蛋白水平增高,但其mRNA水平无显著变化,说明抑制CRY1可逆转CRBC衰老抵抗,提示其作用机制是从蛋白而非转录水平影响P53。Co-IP结果显示,anti-P53的免疫沉淀复合物中检测到MDM2和CRY1,而抑制CRY1可显著降低P53与MDM2的结合。说明CRY1可促进P53与MDM2结合从而促进P53降解。5.AMPK的激活促进PTX诱导的CRBC衰老研究表明,AMPK可以磷酸化CRY1进而促进其MDM2介导的降解。我们发现,CRBC在PTX压力下,激活AMPK可有效降低CRY1蛋白水平,相应的,P53蛋白水平明显增高,衰老细胞增多。相反,抑制AMPK后,P53表达显著降低,细胞无衰老。研究结论1.CRBC在PTX作用下进入静止期且获得抗衰老能力;2.静止期CRBC昼夜节律延长且CRY1蛋白累积;3.CRY1通过促进P53降解介导CRBC衰老抵抗;4.AMPK下调CRY1进而促进CRBC衰老。


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