慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗2年前后肝内T细胞受体文库的变化

【摘要】：研究背景乙型肝炎病毒(HBV)感染可引起急、慢性肝炎,肝衰竭,肝硬化及肝癌等疾病,严重影响全球人类卫生健康。经核苷(酸)类似物(NUC)抗病毒治疗后可明显改善患者病情。近年,高通量测序技术的出现,能使T细胞受体(TCR)文库方面的研究更加全面且深入。然而,针对NUC治疗前后肝内淋巴细胞TCR文库的变化未阐明。研究目的本研究采用5'端cDNA末端快速扩增技术(5'-RACE)扩增TCR β链片段,利用Illumina平台进行高通量测序,深度分析经NUC治疗后肝内淋巴细胞TCR文库的变化,以及发生乙型肝炎e抗原(HBeAg)血清学转换与否和TCR文库变化的联系。研究方法1.研究对象本研究选取12例慢性乙型肝炎(CHB)患者,收集NUC治疗前后血清及肝组织穿刺标本。根据104周是否发生HBeAg血清学转换分为转换(SR)组(n=6)及非转换(NSR)组(n=6)。2.TCR文库构建及测序对血清标本行HBV血清学标志物及血清转氨酶、HBV DNA等检测;对肝组织穿刺标本,提取总RNA,运用5'-RACE逆转录及巢式PCR技术扩增TCR β链,构建测序文库,利用Illumina Hiseq平台行高通量测序。3.测序数据处理及分析采用免疫组库分析软件MiXCR进行V、D、J基因片段比对,识别出有效TCR β链及CDR3序列。相同CDR3序列称为一种克隆型。结果1.CHB患者肝内淋巴细胞TCR VDJ组合使用情况本研究共获得791种不重复VDJ组合,经统计分析,发现有33种不重复VDJ组合频率在基线及104周时有统计学差异,其中有15种基线频率高于104周,有18种104周频率高于基线频率。2.CHB患者抗病毒治疗前后TCR β链文库多样性分析在所有患者中,CDR3克隆型数量在基线时高于104周(P=0.045)。进行分组分析后,SR组的CDR3克隆型数量在基线时显著高于104周(P=0.046),而在NSR组两时间点CDR3克隆型数量无统计学差异。对于相同时间点,SR组与NSR组CDR3克隆型数量均无显著差异。以标准化香农熵(NSDE)作为分析多样性的指标,对于相同时间点,SR组与NSR组T细胞受体文库多样性均无明显差异。从基线至104周两时间的T细胞文库多样性在SR组与NSR组中均无统计学差异。3.CHB患者抗病毒治疗前后TCR β链文库相似性分析在基线及104周均出现的CDR3克隆型称为共有克隆型。除外P15患者共有克隆数达22.5%,其余患者共有克隆比例较低,甚至无共有克隆。经统计分析,SR组与NSR组共有克隆比例无统计学差异。以Morisita-Horn似性指数(MHSI)衡量同一患者两时间点TCR文库的相似性。SR组MHSI指数低于NSR组,但未达到统计学差异。4.TCR CDR3克隆型动态变化与HBV抗原水平及病毒载量的相关性分析SR组消失克隆型(指在基线可检测而在104周检测不到的克隆型)比例与基线到104周的HBsAg水平下降程度呈正相关(r=0.886,P=0.019);NSR组内未发现此现象。消失克隆型比例与基线到104周的HBV DNA定量、HBeAg水平的下降程度无相关关系。结论在HBeAg血清学转换病人中,在TCR文库DNA水平上分析,肝内淋巴细胞可呈克隆性增生,而消失克隆型比例的升高对治疗结局可产生积极的影响。我们推测,经NUC治疗后,肝内可能出现针对某些表位寡克隆强烈增生的T细胞,从而对治疗结局起到积极作用,将来或可利用高通量测序预测疾病预后。