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PPARG/FABP4信号通路介导乳腺癌增殖侵袭能力的体外研究

杨宇钦  
【摘要】:背景与目的:乳腺癌现已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,我国女性乳腺癌发病率虽低于全球发病率,但在2018年新发人数高达367,900人,排位第一,且发病率逐年上升和出现年轻化趋势。提高乳腺癌的诊治水平迫在眉睫。基因芯片技术的诞生与发展使同时研究成千上万的基因表达及相互调控关系成为可能,为基因功能组学的发展安上了强大的“引擎”。PPARG/FABP4通路已被明确与人类肿瘤的多种恶性特征相关,如增殖,侵犯,远处转移等,并涉及多种机制。为进一步探索该信号通路跟乳腺癌的关系,本研究在基因芯片数据挖掘与分析基础上,进行了组织标本及乳腺癌细胞系实验的验证。综上,本研究拟从生信分析及体外实验完成以下目标:(1)生信分析挖掘乳腺癌形成相关差异性基因及通路;(2)组织标本实验明确相关基因的差异性表达;(3)细胞实验探索PPARG/FABP4通路对乳腺癌增殖侵袭能力的影响。材料与方法:1.临床样本收集收集2018年10月至2019年5月南方医科大学南方医院乳腺癌10对术后癌灶及正常腺体样本。2.GEO数据库基因芯片表达数据获取与分析下载包含有癌组织及正常腺体的基因芯片数据3份,利用基于R语言的G02R计算各基因表达情况,按照P0.05及lgFC3或-3筛选出差异性表达基因,进行GO、KEGG分析及PPI网络绘制,利用Cytoscape软件计算Hub基因,最后进行生存分析。3.细胞培养MCF7细胞系及MDA-MB-231细胞系均使用10%FBS的DMEM培养基培养,细胞于培养瓶内融合率达85%左右时进行消化传代,在六孔板中融合率达90%左右时进行后续转染,提RNA/蛋白及功能试验。4.细胞转染按照说明书使用lipo2000对两种细胞进行转染,构建PPARG/FABP4过表达及干扰细胞系。5.RNA提取及q-PCR反应提取组织标本及细胞总RNA,使用SYBR法检测各样本PPARG及FABP4的表达量。6.蛋白质的提取及蛋白印迹使用蛋白裂解液提取各种细胞系的蛋白质,蛋白印迹实验检测各样本中PPARG及FABP4蛋白的表达量及相关关系。7.细胞功能实验使用CCK8、划痕实验及细胞小室实验验证PPARG/FABP4通路对乳腺癌细胞增殖,侵袭转移能力的影响。8.统计所有资料均使用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,计数资料使用两独立样本t检验进行,P0.05为有统计学差异。结果:1.基因芯片数据分析3个芯片共得到共同差异性表达基因146个,生存分析后得到5个与乳腺癌患者预后相关的基因,分别为PPARG,LPL,PLIN1,CIDEC及FABP4,这5个基因的低表达均与更短的总生存时间相关。2.PPARG及FABP4在组织标本的表达对10对乳腺癌患者术后癌标本及正常腺体标本进行q-PCR验证,发现PPARG及FABP4 RNA水平在癌灶低于正常腺体。3.PPARG正性调节FABP4的表达对MCF7及MDA-MB-231细胞进行PPARG及FABP4过表达及干扰后行q-PCR及WB证实PPARG/FABP4正调节。4.PPARG/FABP4通路影响乳腺癌的增殖,侵犯转移能力对进行PPARG及FABP4过表达及干扰的MCF7及MDA-MB-231细胞进行功能实验,结果表明PPARG/FABP4通路上调可抑制乳腺癌的增殖,侵犯转移能力。结论:生信分析结果显示PPARG及FABP4的下调及PPARs通路与乳腺癌的肿瘤形成相关,且这两个基因的下调预示乳腺癌患者更短的总生存时间。PPARG正性调节FABP4的表达,该通路的上调可抑制乳腺癌的增殖及侵犯转移。


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