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《成都医学院》 2016年
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桂皮醛对糖尿病小鼠葡萄糖代谢及血管功能影响的实验研究

王芳  
【摘要】:背景糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)相关血管并发症是危害人类健康的重大疾病,其导致的脑卒中、冠心病、肾功能衰竭是人类致死、致残的重要原因。流行病学研究表明,约有50%~80%的糖尿病患者最终死于心脑血管并发症。目前我国的糖尿病患者已达1.14亿,而成人中更有约50%属糖尿病前期。因此,糖尿病及其相关心血管并发症的防治形势相当严峻。目前药物治疗与冠脉介入技术等已证实可改善或防治糖尿病相关心血管并发症,但上述干预手段并不能有效的降低我国心脑血管疾病的高发率和死亡率。因此,亟待加强相关发病机制的研究,寻找更为有效的干预策略。糖尿病血管损害的发生涉及多种机制,但目前的共识认为,高糖环境下氧化应激水平的升高是糖尿病血管损害的关键共同环节。迄今为止多项临床研究证实,补充外源性抗氧化剂如维生素C和维生素E等,效果并不理想,并存在增加心衰发生的风险。鉴于人类在进化过程中已具备了完善的内源性抗氧化体系,能及时清除体内过多的自由基,因此,通过调控机体内源性的防御体系,恢复氧化/抗氧化体系的平衡,拮抗糖尿病介导的氧化应激水平升高是潜在的防治相关内皮损伤的新策略。因此,研究者将目光转向对内源性抗氧化应激靶点的探索,结果发现包括核因子E2因子相关因子(uclear Factor,erythroid2-like 2,rf2)、解偶联蛋白2(Uncoupling Protein 2,UCP2)、腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、蛋白激酶A(c AMP-dependent protein kinase,PKA)等内源性靶点与心血管疾病的发生、发展密切相关。但如何调控这些内源性的靶点?目前相关的研究较少。近年,他人及课题组的研究发现,一些天然活性成分如辣椒素、姜黄素等可通过调控机体一些内在的靶点,如瞬时受体电位通道香草醛亚家族V1亚型(Transient receptor potential vanilloid subfamily member1,TRPV1)、AMPK、UCP2等具有心血管保护作用。桂皮醛是植物桂皮(Cinnamomum Zeylanicum)中的主要活性成分,早年研究提示其具有抗血栓、对抗病毒诱发的心肌损害等作用,但具体的作用机制不明。近年研究提出桂皮醛可促进肝细胞rf2的转位从而上调II相解毒酶的表达,激活rf2通路改善链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病模型的代谢紊乱,但桂皮醛的调控作用是否与rf2有关有待进一步探讨证实。目的在本研究中,我们利用db/db糖尿病动物模型,以高糖构建人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)细胞模型,观察桂皮醛对糖尿病相关的血管内皮损害的作用,为此,我们提出以下理论假设:桂皮醛通过上调rf2的表达,促进rf2的转位,从而使内源性抗氧化应激相关分子如H¨-1,GPx-1等的表达和活性增强,对抗DM状态下氧化应激水平的升高,防止糖尿病相关血管内皮的损伤及功能障碍,为糖尿病相关血管并发症的防治提供新的干预靶点。材料与方法本研究包括细胞实验及整体动物实验,细胞实验采用荧光染料Dihydroethidium(DHE)检测HUVECs的超氧阴离子水平;采用荧光染料DAF-2DA检测HUVECs的¨水平;Mito-S¨X荧光探针检测HUVECs线粒体活性氧水平。免疫组化检测HUVECs的硝基酪氨酸(itrotyrosine)水平。动物实验采用血糖仪监测空腹血糖;HE染色及免疫荧光染色观察桂皮醛对糖尿病小鼠胰腺形态和胰岛分泌功能的影响;利用荧光染料Dihydroethidium(DHE)、DAF-2DA观察主动脉、肠系膜动脉内膜中的超氧阴离子和¨水平。采用微血管张力测定分析仪分析桂皮醛对db/db小鼠血管功能的影响。机制部分采用rf2 si R A干扰以及rf2抑制剂探讨桂皮醛与rf2之间的相互关系,QRT-PCR观察桂皮醛对血管组织rf2转录水平的影响;Western Blotting观察桂皮醛对db/db小鼠主动脉rf2、H¨-1、CAT、Q¨1、GPx-1表达水平的影响;Elisa试剂盒检测小鼠血浆H¨-1、CAT、Q¨1、GPx-1抗氧化酶水平。结果1.桂皮醛减轻高糖介导的HUVECs氧化应激高糖组超氧阴离子水平、线粒体活性氧水平较低糖组显著升高(P0.01或P0.05),¨水平显著降低(P0.01),而桂皮醛干预后显著降低高糖诱导的HUVECs超氧阴离子及线粒体活性氧水平(P0.01或P0.05)的升高,同时拮抗HUVECs中¨水平的下降(P0.01);细胞免疫组化提示桂皮醛显著降低HUVECs中的itrotyrosine水平。2.桂皮醛对葡萄糖代谢、胰岛及血管形态与功能的影响桂皮醛显著降低db/db小鼠空腹血糖水平(P0.05),同时增加db/db小鼠对胰岛素的敏感性(P0.05),改善胰岛形态及功能,不影响db/db小鼠进食量、体重及鼠尾血压;DHE及DAF-2DA染色提示桂皮醛显著降低db/db小鼠肠系膜阻力动脉、主动脉内膜中超氧阴离子水平(P0.05或P0.01),同时增加动脉组织中¨水平(P0.05或P0.01);桂皮醛显著改善db/db小鼠乙酰胆碱诱导的胸主动脉内皮依赖性舒张功能(P0.01),但对硝酸甘油诱导的胸主动脉非内皮依赖性舒张功能无显著的影响(P0.05);桂皮醛有降低db/db小鼠主动脉内-中膜厚度的趋势,但经统计学分析,无显著性差异,(P0.05)。3.桂皮醛防治糖代谢紊乱介导的血管损伤机制Western blotting结果提示桂皮醛呈浓度依赖性的上调rf2的表达;桂皮醛促进内皮细胞中rf2的核转位;桂皮醛显著对抗高糖诱导的HUVECs中超氧阴离子和线粒体活性氧水平的升高,提高HUVECs中¨水平,而rf2的抑制剂、Si R A干扰后可显著减弱桂皮醛的上述调控作用;长期桂皮醛干预显著上调db/db小鼠主动脉组织中rf2转录水平,同时上调血浆中抗氧化酶水平。结论1.桂皮醛拮抗高糖介导的HUVECs超氧阴离子、线粒体R¨S的产生,防止itrotyrosine水平升高及¨水平的降低;2.桂皮醛降低db/db小鼠空腹血糖,增加胰岛素敏感性,改善db/db小鼠胰岛的形态与功能;同时改善糖尿病小鼠的血管内皮功能;3.桂皮醛通过rf2信号通路促使其下游抗氧化酶基因的表达从而拮抗氧化应激改善糖尿病相关的血管内皮功能障碍。
【学位授予单位】:成都医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R587.2

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