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《成都医学院》 2020年
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细胞焦亡在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用研究

胡兴  
【摘要】:研究背景与目的:缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指围生期窒息导致的脑组织缺氧缺血(hypoxic-ischemic,HI)性损害,是新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因。目前,亚低温是中、重度HIBD足月患儿较为有效的治疗方法,但其治疗时间窗窄、适用范围小,临床仍迫切需要新的治疗策略。HIBD通常以神经细胞死亡为特征,炎症反应是造成HIBD后神经细胞死亡的主要原因之一。细胞焦亡作为一种新的伴有炎症反应的程序性细胞死亡方式,其经典途径需依赖Caspase-1的活化,在HIBD中的作用尚不十分清楚。经典的细胞焦亡过程是,NLRP3炎症小体的激活介导Caspase-1的活化,最终会导致促炎细胞因子IL-18和IL-1β的活化和分泌,加重炎症反应,最终引起细胞损伤。此外,活性Caspase-1还可激活GSDMD,使成熟的IL-1β和IL-18分泌到胞外发挥相应的作用。目前,Caspase-1的活化被认为是细胞焦亡的关键环节。Caspase-1特异性抑制剂VX-765可透过血脑屏障,能有效抑制Caspase-1活化介导的促炎过程。本研究通过建立HIBD新生大鼠模型,检测细胞焦亡相关指标的表达情况,探究NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡是否参与HIBD发病过程;以及VX-765能否抑制Caspase-1的活化,减轻缺氧缺血性脑损伤的严重程度,发挥神经保护作用,并改善学习、记忆功能,为治疗新生儿HIBD提供理论依据。材料与方法:1、将7日龄新生SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(HIBD)组,参照改良Rice法建立HIBD新生大鼠模型。于术后24h、48h、72h各时间点取脑组织,Western blot检测左侧海马组织中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达变化情况及表达高峰时间点。术后72h,应用HE染色和尼氏染色观察左侧海马DG区脑组织病理变化及神经元损伤情况;免疫组织化学染色检测左侧海马DG区NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达情况;Western blot及RT-PCR检测左侧海马组织中NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡相关分子(NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-β、IL-18)蛋白及mRNA表达情况。2、将7日龄新生SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(HIBD)组及Caspase-1抑制剂VX-765处理HIBD(VX-765)组。VX-765组分别于术后0h、24h、48h,腹腔注射VX-765溶液(50 mg/kg),Sham组和HIBD组腹腔注射等量生理盐水。术后72h,采用Western blot及Rt-PCR检测大鼠左侧海马组织中细胞焦亡相关蛋白及mRNA(Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18)表达情况;ELISA检测大鼠左侧海马组织中炎症细胞因子(IL-1β、IL-18)水平变化;HE染色及免疫组织化学染色观察大鼠左侧海马CA1区脑组织病理变化、神经元损伤情况;TTC染色法检测大鼠脑组织梗死面积;大鼠生后28天,Morris水迷宫等行为学实验评估大鼠学习记忆功能。结果:1、Western blot结果显示,与Sham组相比,HIBD组术后24h、48h NLRP3蛋白表达水平升高;术后72h ASC及Caspase-1蛋白表达水平升高;术后各时间点pro-Caspase-1蛋白表达水平无明显变化。HIBD新生大鼠左侧海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达高峰时间分别在术后24h、72h、72h。2、HE染色结果显示,与Sham组相比较,HIBD组左侧海马DG区细胞层数相对减少、细胞排列相对不规则。3、尼式染色结果显示,HIBD组左侧海马DG区神经元数目丢失较Sham组增多。4、免疫组织化学染色结果显示,HIBD组左侧海马DG区中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达增强。5、Western blot及RT-PCR结果显示,HIBD组左侧海马组织中细胞焦亡相关蛋白及mRNA(NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18)表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05)。6、VX-765干预后,Western blot及RT-PCR结果显示,与Sham组相比较,HIBD后新生大鼠左侧海马组织细胞焦亡相关蛋白及mRNA(Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18)表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);与HIBD组相比较,VX-765组新生大鼠左侧海马组织细胞焦亡相关蛋白及mRNA表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。7、VX-765干预后,ELISA检测结果显示,与Sham组相比较,HIBD后新生大鼠左侧海马组织中炎症细胞因子水平(IL-1β、IL-18)明显增加(P0.05);与HIBD组相比较,VX-765组新生大鼠左侧海马组织中炎症细胞因子水平(IL-1β、IL-18)明显减少(P0.05)。8、VX-765干预后,免疫组织化学结果显示,与Sham组相比较,HIBD后新生大鼠左侧海马CA1区神经元细胞丢失明显,NeuN~+细胞数明显减少;与HIBD组相比较,VX-765组新生大鼠左侧海马CA1区神经元丢失减轻,NeuN~+细胞数减少。9、VX-765干预后,TTC染色法结果显示,与Sham组相比较,HIBD后大鼠左侧大脑半球梗死面积显著增加;但与HIBD组相比较,VX-765组大鼠左侧大脑半球梗死面积减少不明显。10、VX-765干预后,Morris水迷宫等行为学实验检查结果显示,与Sham组相比较,HIBD后大鼠逃避潜伏期延长、穿台次数减少;与HIBD组相比较,VX-765组大鼠逃避潜伏期缩短、穿台次数增加均不显著。结论:NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡参与HIBD新生大鼠的发病机制;VX-765通过抑制Caspase-1的活化,有效抑制了HIBD后新生大鼠损伤侧海马组织中细胞焦亡的发生,减轻了HIBD后新生大鼠海马区的炎症反应及神经元损伤,但不能显著减少HIBD大鼠损伤侧大脑半球梗死面积,及改善学习和记忆功能。
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