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《成都医学院》 2020年
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褪黑素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的作用及机制研究

苟知贤  
【摘要】:研究背景与目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-Ischemic Brain Damage,HIBD)是导致儿童学习障碍、癫痫甚至脑瘫等后遗症的主要病因,神经元死亡是其神经后遗症难以恢复的重要机制。因此,保护受损神经元、减少其死亡是目前防治HIBD神经后遗症的主要策略。铁死亡是一种新发现的依赖脂质过氧化的细胞死亡机制,在多种神经系统疾病中扮演着重要角色。近年来有研究表明,褪黑素(Melatonin,Mel)具有脂溶性高、毒性低和抗氧化能力强等优点,Mel联合亚低温治疗缺氧缺血性脑病,可以减少患儿急性死亡,改善预后,但其机制仍不清楚。本研究拟通过HIBD大鼠模型探讨Mel改善HIBD预后的潜在机制,为Mel应用于临床HIBD防治提供可靠的实验基础和理论依据。材料与方法:按Rice法建立HIBD新生大鼠模型。通过Western blot检测损伤侧海马组织中铁死亡关键调控酶Gpx4在缺氧缺血后不同时间点(3h、6h、12h、24h、48h和72h)的表达,筛选出Gpx4表达谷值的时间点,即后续取样时间。腹腔注射低、中、高剂量的Mel,通过Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能,筛选出Mel给药剂量。首先,将大鼠随机分为Sham组和HIBD两组,采用HE染色检测海马组织的病理表现,免疫组织化学染色检测NeuN阳性(NeuN~+)神经元,透射电镜检测海马神经元线粒体的病理表现,Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)和4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的蛋白水平,特异性试剂盒检测谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,以了解铁死亡在HIBD发病机制中的作用。其次,将大鼠随机分为Sham组、HIBD组、对照(DMSO)组和Mel治疗(Mel)组,采用上述方法检测损伤侧海马组织病理表现、NeuN~+神经元、铁死亡标志物(Gpx4、4-HNE和GSH)及神经元线粒体病理表现,以研究Mel对HIBD大鼠海马神经元铁死亡的作用。最后,将大鼠随机分为Sham组、HIBD组、DMSO组、Mel组、PI3K/Akt抑制剂LY294002干预Mel(LY294002)组、Nrf2抑制剂ML385干预Mel(ML385)组和Gpx4抑制剂RSL3干预Mel(RSL3)组。采用Western blot检测Akt、p-Akt、Nrf2、Gpx4和4-HNE的蛋白水平,特异性试剂盒检测GSH的含量,Morris水迷宫测试评估大鼠学习记忆功能,以探讨Mel改善HIBD预后的机制。结果:(1)HIBD后神经元铁死亡的发生Gpx4的表达在HI后6h、12h、24h、48h和72h均显著降低,于48h达谷值。与Sham组比较,HIBD大鼠海马CA1区细胞排列散乱,核小、变暗,甚至碎裂,NeuN~+神经元数目减少,海马组织中铁死亡标志物Gpx4和GSH表达降低,4-HNE表达增加,神经元线粒体皱缩、线粒体膜密度增加。(2)Mel对HIBD大鼠海马神经元铁死亡的作用Morris水迷宫测试结果显示,与Sham组比较,HIBD组大鼠逃避潜伏期明显增加,穿台次数显著减少。与DMSO组比较,Mel(10mg/kg)和Mel(20mg/kg)组大鼠逃避潜伏期相对减少,穿台次数增加,尤其是Mel(10mg/kg)组。与DMSO组比较,Mel(10mg/kg)组大鼠损伤侧海马CA1区细胞排列相对规则,核较大、较圆,NeuN~+神经元数目增加,海马组织中铁死亡标志物Gpx4和GSH表达增加,4-HNE表达减少,神经元线粒体皱缩、线粒体膜密度增加相对减轻。(3)Akt/Nrf2/Gpx4信号通路在Mel脑保护机制中的作用与Mel(10mg/kg)组比较,LY294002组、ML385组和RSL3组大鼠损伤侧海马CA1区细胞排列相对散乱,核小、变暗,NeuN~+神经元数目减少,铁死亡标志物Gpx4和GSH表达降低,4-HNE表达增多,神经元线粒体皱缩、线粒体膜密度增加明显,且大鼠逃避潜伏期显著增加,穿台次数减少。结论:神经元铁死亡是HIBD学习记忆功能损伤的重要机制,而Mel可通过Akt/Nrf2/Gpx4信号通路抑制神经元铁死亡,从而改善HIBD学习和记忆功能。
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