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《中国科学院大学(中国科学院物理研究所)》 2018年
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DNA及染色质高级结构的单分子研究

王一舟  
【摘要】:本文主要介绍以下三个方面的工作:第一,我们搭建了高性能的单分子磁镊;第二,我们利用磁镊技术解析了MeCP2蛋白组装的染色质纤维结构,并通过其动力学特性提出了这种染色质纤维新结构的组装模型;第三,我们利用磁镊研究了人类端粒处多G-quadruplex(G4)系统的稳定性和折叠动力学,证实了多个G4之间相互作用的存在。论文工作主要取得了以下进展。(1)我们搭建了新的高性能单分子磁镊。在硬件上,我们使用了高采样率的CCD相机和大视场的物镜,能在提高数据时间分辨率的同时显著增加同时监测的单分子样品个数;软件上,我们重新开发了磁镊装置的控制软件,利用全新的图像分析算法大大提升了仪器的分辨率,此外,我们还利用PID反馈原理设计了热漂移反馈系统,使磁镊能在长时间的测量中不受热漂移的干扰。新磁镊的搭建为我们后续课题的开展打下了良好的基础。(2)我们解析了MeCP2组装的染色质纤维高级结构MeCP2-Chromatin。我们发现MeCP2-Chromatin不同于任何已知的染色质结构,并具有如下特点:首先,MeCP2-Chromatin具有高度的协同性,会在10pN附近迅速完全展开;其次,Me CP2-Chromatin的展开模式有着明显的规律,总是以50nm/100nm的步长交替展开,暗示着内部以3个或6个核小体为一组的组装模式;最后,MeCP2-Chromatin具有极强的再组装能力,在多次完全展开后仍然能够自发再组装为染色质纤维结构。我们通过截断MeCP2蛋白的N端和C端,发现MeCP2-Chromatin的形成不受影响,但是N端截断的MeCP2-Chromatin结构更加紧密,C端截断的MeCP2-Chromatin更加松散。依据以上实验结果,我们提出了以6个核小体为一组的MeCP2-Chromatin组装模型,并尝试解释了其展开模式的分子机制。以我们的模型为基础,我们的合作者成功得到了6个核小体组装的MeCP2-Chromatin的冷冻电镜成像。此外,我们还研究了R106W和P225R等导致Rett syndrome的MeCP2突变对染色质纤维结构的影响,发现P225R会明显增强染色质纤维结构的稳定性。这一结果可能会为Rett syndrome等疾病的治疗提供新的视角。(3)我们利用双G4系统研究了人类端粒处多个G4间的相互作用。我们的实验结果表明足够长的端粒DNA单链可以形成连续的G4结构。进一步,我们发现多个G4之间存在着稳定的相互作用,这种相互作用对系统有两重影响:促进了双G4系统的稳定性,并显著延长了G4在展开态和折叠态停留的时间。我们还通过对G4之间的连接DNA进行突变,使得G4之间的相互作用消失,证明了G4间的相互作用需要连接DNA的参与,而且没有相互作用的多G4系统本身极不稳定。最后,我们提出多G4系统会牺牲自由能中熵的部分,这是多G4系统稳定性下降的根源,G4之间的相互作用能帮助多G4系统稳定,但总体稳定性仍然会下降,因此在端粒末端不会形成最大数量的G4结构,总会暴露一部分单链,这可能会为端粒蛋白的结合提供位点。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院物理研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q343.2

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