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《中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)》 2016年
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DNA四面体纳米结构探针设计及细胞标记成像应用

韦贵生  
【摘要】:DNA四面体纳米结构是一种非常优异的DNA纳米结构,通过精确巧妙的DNA序列设计以及根据碱基互补配对的原则,每两条链相互杂交组合形成具有四面体形状的DNA三维纳米结构。DNA四面体具有精确的结构可控性、良好的生物相容性及优异的细胞膜通透性,这些特点都说明了DNA四面体结构十分适合作为纳米传感元件应用于生物检测以及生物医药领域的研究。当前纳米传感器已经成为生物分子检测的重要方法之一,基于mRNA检测成像对生物学研究、疾病治疗以及组织细胞标记的重要性,我们结合DNA四面体纳米结构与mRNA检测探针,设计一个可以实现组织细胞特异标记的mRNA信标模型。本论文中,我们首先在两种细胞株中研究细胞对DNA四面体的吸收,以及在体外培养海马神经元细胞并研究神经元对DNA四面体的摄取情况;接着通过显微注射的方式和活体电转的方式在小鼠中枢神经组织中探究神经细胞对DNA四面体的吸收;最后结合DNA四面体结构和mRNA探针,设计构建了基于DNA四面体的mRNA信标模型(TDNs-flare),在中枢神经组织中对特定类型神经细胞进行有效的标记。具体情况如下:第一,以边长为20bp的DNA四面体作为本研究的DNA纳米结构,通过结构的组装、表征和纯化,并分别在Hela细胞和PC12细胞两种类型细胞株中研究其对DNA四面体结构的摄取情况。结果说明在细胞孵育12h的时间里两种细胞都能对DNA四面体进行高效的细胞摄取;接着在体外培养海马神经元细胞并对其进行免疫荧光的鉴定,在与DNA四面体细胞孵育12h的过程中,海马神经元同样能够摄取DNA四面体并且具有一定的吸收效率,此结果为后续在神经组织中DNA四面体的研究和应用奠定了重要的实验基础。第二,首先通过显微注射的方式在小鼠海马齿状回中比较DNA四面体与DNA双链两种结构被组织细胞摄取的情况,发现只有三维结构的DNA四面体才能被神经细胞摄取;同时还研究了不同时间点上组织细胞对DNA四面体的吸收,说明了在24h左右的时间里DNA四面体具有最好的吸收效果;接着我们探索了利用添加0.1%saponin和0.2%Triton的方式以及活体电转的方式提高皮层组织对DNA四面体的摄取效率,结果三种方法都能够显著提高皮层组织对DNA四面体的吸收;为了使DNA四面体应用于组织水平上mRNA的检测成像,我们利用荧光共振能量转移的原理探究DNA四面体在组织细胞中的代谢时间与其自身结构完整性的关系,结果证明24h之内大部分的DNA四面体还能保持着结构的完整性。第三,根据DNA四面体结构的基本模型在其一条边长上设计延长一段可以与mRNA探针互补配对结合的DNA序列,构建了基于DNA四面体的mRNA信标(TDNs-flare)。通过对中枢神经细胞中特异类型细胞的标记物mRNA识别序列的筛选,最终确定actin-flare、vgat-flare、pv-flare和vip-flare四种mRNA检测的信标模型;利用与mRNA识别序列相同的DNA片段作为靶分子,通过与四种TDNs-flare的识别检测研究,证明四种TDNs-flare都具有优异的检测信噪比和识别特异性;通过活体电转的方式,vgat-flare在皮层的标记成像中获得较好的细胞标记效果;设计vgat-flare-cy5用于检测vgat神经元,进一步证明使用TDNs-flare进行组织细胞标记的有效性。
【关键词】:DNA四面体 纳米传感 mRNA检测 细胞标记 中枢神经
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q503
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-12
  • 第一章 绪论12-26
  • 1.1 mRNA检测成像12-14
  • 1.1.1 mRNA检测成像的重要性12-13
  • 1.1.2 mRNA检测成像的传统方法13-14
  • 1.2 mRNA纳米传感器14-15
  • 1.3 四面体DNA纳米结构15-17
  • 1.3.1 DNA纳米技术15-16
  • 1.3.2 DNA四面体的研究进展16-17
  • 1.4 中枢神经细胞的成像标记17-19
  • 本课题的提出19-20
  • 参考文献20-26
  • 第二章 DNA四面体的合成以及体外细胞摄取研究26-42
  • 2.1 引言26-27
  • 2.2 试剂与仪器27-28
  • 2.2.1 试剂27
  • 2.2.2 仪器27-28
  • 2.3 实验方法28-32
  • 2.3.1 溶液的配置28
  • 2.3.2 DNA引物单链的定量28-29
  • 2.3.3 DNA四面体的组装合成29
  • 2.3.4 DNA四面体的电泳表征及AFM表征29-30
  • 2.3.5 DNA四面体的液相分离30
  • 2.3.6 原代神经元的培养及鉴定30-31
  • 2.3.7 体外细胞摄取实验31-32
  • 2.3.8 激光共聚焦显微成像32
  • 2.4 结果与分析32-37
  • 2.4.1 DNA四面体的合成与表征32-33
  • 2.4.2 DNA四面体的液相分离33-34
  • 2.4.3 原代神经元培养及鉴定34-35
  • 2.4.4 DNA四面体在Hela和PC12细胞的摄取研究35-36
  • 2.4.5 DNA四面体在海马神经元的摄取研究36-37
  • 本章小结37-38
  • 参考文献38-42
  • 第三章 DNA四面体在中枢神经组织中的摄取研究42-61
  • 3.1 引言42-43
  • 3.2 试剂与仪器43-44
  • 3.2.1 试剂43
  • 3.2.2 仪器43-44
  • 3.3 实验方法44-46
  • 3.3.1 玻璃电极的制备44
  • 3.3.2 小鼠脑组织压力注射DNA四面体44-45
  • 3.3.3 小鼠脑组织电转DNA四面体45
  • 3.3.4 小鼠灌流以及组织后固定45
  • 3.3.5 脑组织切片的制备及荧光观察45-46
  • 3.4 结果分析46-55
  • 3.4.1 小鼠组织压力注射DNA四面体的研究46-50
  • 3.4.2 小鼠组织电转DNA四面体的研究50-51
  • 3.4.3 小鼠组织中DNA四面体结构完整性的研究51-55
  • 3.5 本章小结55-57
  • 参考文献57-61
  • 第四章 基于DNA四面体的mRNA探针的构建以及功能应用61-81
  • 4.1 引言61-62
  • 4.2 试剂与仪器62-63
  • 4.2.1 试剂62
  • 4.2.2 仪器62-63
  • 4.3 实验方法63-66
  • 4.3.1 DNA引物单链的定量63
  • 4.3.2 TDNs-flare的组装以及结构表征63-64
  • 4.3.3 TDNs-flare的液相色谱分离64
  • 4.3.4 TDNs-flare的体外检测64-65
  • 4.3.5 小鼠脑组织液压注射以及电转TDNs-flare65
  • 4.3.6 小鼠灌流以及组织后固定65
  • 4.3.7 脑组织切片的制备及荧光观察65-66
  • 4.4 结果分析66-77
  • 4.4.1 TDNs-flare结构的设计及组装66-67
  • 4.4.2 mRNA的选择以及探针的筛选67-70
  • 4.4.3 TDNs-flare的结构电泳表征及液相色谱分离70-71
  • 4.4.4 TDNs-flare的体外检测71-73
  • 4.4.5 TDNs-flare在组织体内的检测成像73-77
  • 4.5 本章小结77-78
  • 参考文献78-81
  • 攻读硕士期间已发表和待发表论文81-82
  • 致谢82

【参考文献】
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