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碳离子辐照引起的线粒体DNA损伤突变及相关方法学研究

何阳  
【摘要】:目的:确定碳离子辐照引起的线粒体DNA损伤和突变情况;探讨利用硅碳量子点标记线粒体的可能性;初步研究线粒体活性氧激发剂的生物学效应。 材料和方法:采用12C6+离子束或X射线对肿瘤细胞进行辐照,荧光定量PCR进行线粒体DNA5464-7287编码区损伤和4977大片段缺失定量检测;辐照后克隆存活检测;直接测序法检测D310区点突变。细胞MTT实验检测硅碳量子点(SiCDs)的细胞毒性,酶标仪检测硅碳量子点处理后细胞和斑马鱼体内SOD、MDA和ROS的含量,激光共聚焦确定其染色部位。MTT实验和酶标仪检测光诱导型线粒体活性氧激发剂Mitochondros的发光特性及细胞毒性。 结果:线粒体DNA5464-7287编码区对0.5-2Gy碳离子辐射有很高的敏感性,预先半小时加入维生素C后的样本线粒体DNA损伤明显减少。以10%存活分数(D10)作为标准,碳离子对MCF-7细胞的相对生物学效应为3.1(1.5Gy碳离子/4.65Gy X射线)。D310区SNP位点克隆突变检测发现碳离子辐照后存活的MCF-7细胞中正常C7序列比X射线辐照后明显减少(58%vs.74%),单碱基插入C8和单碱基缺失C6的丰度则明显升高,分别是18%和24%。碳离子和X射线辐照后MCF-7细胞中线粒体DNA4977缺失的变化趋势在72小时内表现一致,照后24小时达到峰值,并在随后的48小时和72小时时间点迅速下降至本底水平。射线类型对线粒体DNA4977缺失的产生无明显区别。生物相容性检测显示低浓度SiCDs对24h细胞和斑马鱼存活无影响,其染色后细胞和斑马鱼的SOD及MDA含量降低。SiCDs的染色性质测定表明SiCDs在活细胞及活体成像中荧光信号强,耐光性好,且在405、488和555nm均可检测到荧光信号,SiCDs对HepG2的染色没有进入细胞核,只有胞质区表现出荧光。中低浓度的线粒体活性氧激发剂Mitochondros培养24h对HepG2细胞存活无影响,其激发和发射波长在428nm和600nm,培养24h后细胞中Mitochondros的荧光检测发现除最低浓度0.1ng/ml外,其他浓度的Mitochondros荧光强度与0.1ug/ml的最高荧光强度值无明显区别。 结论:碳离子辐照会引起严重的线粒体DNA5464-7287编码区损伤,损伤主要来源于氧化胁迫。碳离子对MCF-7细胞的杀伤作用明显强于X射线,且其对于D310区的致突变能力显著高于X射线辐照。线粒体DNA4977bp缺失的存在对宿主细胞能够产生严重的氧化胁迫,在大多数情况下不能在存活细胞中得到遗传,且碳离子与X射线所引起的线粒体DNA大片段缺失突变没有本质区别。低浓度SiCDs对细胞和斑马鱼没有毒性,荧光信号强,耐光性好,适合作为生物学荧光标识物,其线粒体靶向性有待提高。中低浓度线粒体活性氧激发剂Mitochondros培养24h对细胞没有毒性,线粒体内能容纳的Mitochondros的量是一定的,初步说明其适合作为细胞中的活性氧激发剂。结合之前的MTT实验,最高荧光强度值的浓度0.1ug/ml可以作为后续实验的标准浓度。


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