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DNA甲基化修饰影响三维结构细胞辐射敏感性

潘冬  
【摘要】:目的: 模拟体内环境进行人体细胞的体外三维(3D)方式培养,被认为是介于传统的单层(2D)培养细胞与动物模型之间的第三种生物与医学实验的理想模型,更接近于人体的实际。研究显示,3D细胞比2D细胞具有辐射抗性,但其内在机理还不甚清楚。 DNA甲基化修饰是表观遗传学调控的一个重要方面,当前的研究试图从这一角度来揭示调控3D细胞辐射敏感性的相关机理。 材料与方法: 本研究以二维(2D)、三维(3D)培养模式下的肺腺癌细胞A549细胞系为研究对像,首先检测了DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对2D与3D培养的肺腺癌细胞A549辐射敏感性及细胞周期分布的影响,继而采用全基因组甲基化试剂盒对2D与3D培养细胞辐照前后样品进行整体甲基化程度检测;进一步,我们利用DNA甲基化芯片对与细胞周期和DNA修复相关基因的启动子甲基化程度进行检测,并使用甲基化特异性PCR(MSP)方法重点检测5-Aza-CdR处理对CCNF、CCND1和RBL1启动子甲基化水平影响并利用实时荧光定量PCR检测这些基因的转录水平。 结果: (1)5-Aza-CdR抑制A549细胞增殖,呈剂量依赖性。2、5μM药物预处理的3D培养A549细胞辐照后微核数目较未用药处理组显著增加,克隆存活率较未用药组降低,而在2D培养A549细胞中仅在5μM药物处理时观测到上述现象。5-Aza-CdR能够引起A549细胞G2/M期比例增加,3D细胞增加程度更为明显,但2D细胞辐照后发生更为严重的G2/M期阻滞。 (2)经X射线和重离子辐照以及5-Aza-CdR处理后,2D与3D培养模式下A549细胞全基因组甲基化水平呈下降趋势,但2D与3D细胞之间全基因组甲基化水平无明显差异。 (3)3D培养A549细胞中多个与周期调控和DNA损伤修复相关基因启动子甲基化程度较高,辐照后发生去甲基化;2D培养A549细胞中基因启动子辐照前后一直处于低甲基化状态。MSP检测发现3D细胞中CCND1、CCNF和RBL1基因启动子经5-Aza-CdR处理后去甲基化。 (4)辐照后2D和3D细胞中CCND1、CCNF和RBL1基因转录水平均不同程度升高;而5-Aza-CdR处理后,仅在3D细胞当中能够引起CCND1、CCNF和RBL1基因的mRNA水平明显升高,而在2D培养A549细胞中此现象不明显。 结论: 我们的结果表明,特异性去甲基化试剂5-Aza-CdR能够增强3D细胞的辐射敏感性并调控细胞周期,为5-Aza-CdR在临床上与放疗结合靶向治疗肿瘤、降低药物毒副作用提供了理论基础。基因组整体甲基化程度在细胞辐射应答过程有变化,但与2D、3D结构细胞之间辐射损伤差异性无明显联系。3D结构细胞中,某些与细胞周期及DNA损伤修复相关的关键基因启动子高甲基化导致转录水平受到抑制,可能影响了辐射的敏感性。


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