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重离子诱变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究

李垄清  
【摘要】:酵母β-葡聚糖作为酵母细胞壁的主要成分,是一种重要的功能性多糖,它不仅具有增强机体免疫功能、抗炎症、抗肿瘤等多重功效,被广泛应用于医药行业及肿瘤的治疗中,还可作为保水剂、膳食纤维等功能因子用于食品生产行业中。酵母作为重要的β-葡聚糖来源,如何提高酵母细胞壁β-葡聚糖的含量,以获得高产量的β-葡聚糖酵母菌种,是本文研究的重点。本研究利用12C6+离子束辐照处理面包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),选育出高产β-葡聚糖的优良面包酵母菌株100G-9,同时通过建立高通量的酵母β-葡聚糖筛选检测方法,便于更高效地筛选突变株;通过优化诱变面包酵母菌株100G-9的培养条件及细胞壁内酵母β-葡聚糖的提取工艺,达到提高诱变酵母菌株100G-9的生物积累量及β-葡聚糖得率的目的。本研究为重离子诱变选育优良面包酵母菌株提供科学依据,并为今后酵母β-葡聚糖的工业化生产奠定了理论和实验基础。1.重离子辐照选育高产β-葡聚糖酵母菌株实验对原始酵母菌株(CK)经过不同剂量的12C6+离子束辐照诱变,统计得到酵母细胞的存活率。结果表明酵母菌株的半致死剂量约为100Gy,且在该辐照剂量下有利于突变酵母菌株的筛选;利用苯酚-硫酸法对酵母β-葡聚糖的含量进行测定,采用96孔板与酶标仪结合的方法代替紫外分光光度计法,建立了高通量、快速的微量检测方法,提高了酵母突变菌株的筛选效率。经过优化后的检测样品单孔进样量为200ul,单次进样数为96个,且检测精密度良好,当样品浓度的范围在0.001-0.25mg/ml区间内时,相关系数R20.99。筛选得到了5株高产β-葡聚糖酵母菌100G-1、100G-9、80G-25、140G-7以及100G-2,经过连续9代的斜面传代培养后,遗传稳定性良好。2.高产β-葡聚糖面包酵母菌生长条件的优化研究实验优化了高产诱变酵母菌株100G-9的培养基,包括:碳源、氮源及无机盐,并得到该菌株最适培养基配比:甜高粱汁4.0%,蛋白胨0.5%,牛肉膏1.0%,酵母抽提物0.5%,K+离子0.1%,Mg2+离子0.1%。在此条件下,100G-9酵母菌株的生物量积累可达到8.16g/L,比未经优化的对照组高出5.8%。实验表明,通过优化培养基配比,可以有效提高酵母的生物量积累。3.酵母β-葡聚糖提取条件的正交优化为了获得100G-9酵母菌株的β-葡聚糖最佳提取条件,将提取过程中涉及的三个重要因素进行了正交优化,三种不同的提取因素对β-葡聚糖得率的影响程度分别为:NaOH浓度提取温度提取时间,最佳的提取条件为:NaOH浓度2.0mol/L,提取温度90℃,提取时间2.5h。正交优化后的酵母β-葡聚糖得率可达到12.51%,β-葡聚糖的纯度可达到95.21%,与原始的提取条件相比β-葡聚糖得率提高了3.23%,β-葡聚糖的纯度与以往文献所报道的90.6%的纯度含量相比提高了4.61%。


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