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《中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所)》 2018年
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中能碳离子束辐射百脉根突变体库创制及花瓣衰老延迟突变体机理研究

骆善伟  
【摘要】:中能重离子束诱变育种具有诱变率高和突变谱广的特点,广泛运用于植物诱变育种工作中。豆科植物的离子束诱变育种工作已经多有开展,并且取得了丰硕的成果,但其诱变机理研究还相对缺乏。本研究以豆科模式植物百脉根(生态型:MG-20)为研究材料,采用碳离子束辐射百脉根干种子,从M_2代群体进行突变体筛选,对突变率和突变谱进行量化分析,并使用ISSR技术对辐射后代进行遗传多态性表征。M_2群体筛选获得了花瓣衰老延迟突变体(Petal senescence delayed,PSD),借助全基因组重测序分析和转录组测序分析寻找PSD的突变基因和差异表达基因。对转录组数据进行深入挖掘,探索百脉根花瓣衰老的基因调控网络。使用兰州重离子研究装置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou,HIRFL)提供的能量为80MeV/u的碳离子束辐射百脉根干种子,辐射的剂量为0、100、200、300、400、500和600 Gy,统计M_1代的萌发率、存活率和根长。结果表明萌发率与剂量无相关关系,存活率与根长随剂量升高而下降。最终选择400 Gy作为半致死剂量,辐射1200粒M_1代种子,从2472份M_2个体中筛选获得127个表型发生变异的个体。突变群体的变异类型包括叶突变、茎突变、花突变和果实突变,总突变率为5.14%。然后采用简单重复序列间区(Inter simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术分析M_2代植株的基因组DNA多态性。选取了7个有突变表型的M_2个体和8个没有突变表型的M_2个体进行ISSR分析,多态性条带为4条,其中7个有表型个体中共发现2条多态性条带,多态率为0.607%,8个无明显表型个体中有2条多态性,多态率为0.532%,两组间无显著差异,总多态率为0.567%。碳离子束辐射百脉根获得PSD突变体未见报道,该突变体花瓣衰老延迟显著,具有较大的研究价值和潜在的经济价值。结果表明PSD单朵花的花期比野生型(WT)长10天以上,PSD的果荚比WT略短,种子数比WT略少,但均不能到达显著差异水平。生长周期、植株形态、叶型和花型均与WT无显著差异。台盼蓝染色实验和半薄切片实验结果表明:授粉后PSD花瓣细胞存活时间长于WT;花瓣萎蔫后,PSD台盼蓝染色区域少于WT,细胞结构较WT完整。通过重测序与转录组关联分析,推测CUFF.19232为引起PSD花期延长的突变基因。CUFF.19232注释为木瓜蛋白酶类的半胱氨酸肽链内切酶(CysEPs),包含了一类C-末端KDEL类内质网保留信号因子(KDEL-CysEPs),与拟南芥AT5G50260(KDEL-CysEPs)相似率为82%,具有泛蛋白酶特点。该基因的具体的功能还需进一步研究。花瓣衰老是植物生长发育的重要过程之一,百脉根中花瓣的衰老调控机制仍不甚明了。本研究以百脉根野生型材料(WT)为主要研究对象,探索参与百脉根花瓣衰老的基因,并用PSD突变体作为验证。通过对WT和PSD中差异表达基因的分析,筛选出4个关键衰老相关基因和22个泛素化相关基因参与了百脉根花瓣衰老。74个转录因子家族参与百脉根花瓣衰老的信号传导,其中AP2-ERFBP家族成员最多。并筛选出参与百脉根花瓣衰老的7种植物激素相关基因,其中乙烯合成关键基因ACS1和ACO1表达上调,多个乙烯响应转录因子(RAP2-3,ERF010,ERF060和ERF112)表达上调。对这些基因的RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。体外喷洒乙烯生物合成中间体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)和抗乙烯剂硫代硫酸银(silver thiosulfate,STS)实验表明,ACC能够加速花瓣衰老,STS则能够有效延缓花瓣衰老,进一步说明乙烯是参与百脉根花瓣衰老的关键因素。通过上述研究,我们建立了中能碳离子束辐射百脉根M_2代突变体库,并且用分子标记方法考察了辐射诱变对后代DNA多态性的影响。花瓣衰老突变体经基因组和转录组关联分析,初步认为CUFF.19232是引起PSD花瓣衰老延迟的突变基因。另外,本研究对百脉根花瓣转录组进行了深入挖掘,探索了参与百脉根花瓣衰老的基因,证明了授粉是花瓣衰老的一个重要时间点,而且乙烯在百脉根花瓣衰老中有重要作用。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2;S335.2

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