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非编码RNA对结肠癌细胞重离子辐射敏感性的调节作用

李宏斌  
【摘要】:放疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部肿瘤治疗方法,目前,大约有50%-70%的肿瘤患者在治疗过程中需要用到放疗。放疗作为肿瘤的三大治疗手段(手术,放疗,化疗)之一,因其适用范围广,治疗过程相对简便,疗效确切,方法可靠,毒副作用相对较小,既可单独应用,也可以与手术、化疗联合应用。因此,放疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出。结直肠癌是世界范围内最常见的消化系统肿瘤之一,其恶性程度高,预后差。放疗作为结直肠癌临床治疗的重要手段,在控制肿瘤生长,减小肿瘤体积等方面具有明显的优势。与常规光子放疗射线相比,高LET(Linear Eenergy Transfer)的重离子射线具有其独特的布拉格峰型(Bragg Peak)剂量分布,即在物质中的剂量损失集中于射程末端,这种物理学特性使重离子射线在肿瘤放疗应用中具有明显的优势,可有效地将高能量重离子射线集中到肿瘤靶区,不但能提高肿瘤治疗效果,并能减少放射线对正常组织的伤害。然而,影响放疗疗效的因素很多,除了放射线品质(放射源)外,还取决于肿瘤细胞的放射敏感性,一些肿瘤细胞固有或获得性的辐射抗性大大降低了放射线对其的杀伤作用,从而限制了放疗的应用。因此,通过研究肿瘤细胞对辐射的应答机制及辐射抗性产生的分子机制对于提高放疗的局部控制率和生存率;降低正常组织毒副作用以及增加新的放疗适应症都具有重要的意义。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)能够多层次,多途径的调节基因表达,从而广泛参与了包括细胞增殖,分化,凋亡,自噬等细胞生命过程的调节。辐射能够引起细胞内很多ncRNAs的表达变化,进而通过ncRNAs调节网络广泛参与细胞对辐射的应答反应。文献报道证实,ncRNAs在调节肿瘤细胞对电离辐射的反应中发挥了重要的调节作用。然而其确切的分子机制仍有待研究。在本研究中,我们使用microRNA(miRNA)芯片研究了重离子射线(碳离子)对人结肠癌细胞系HCT116细胞miRNAs表达谱的影响,结果表明,1Gy和2Gy的重离子照射HCT116细胞后,分别有22个和19个miRNAs的表达发生了变化。其中,重离子辐照后,miR-6778-5p的表达量明显下调。我们通过real-time PCR在三株不同的结肠癌细胞系中(HCT116,HT29,SW620)对这一结果进行了验证。细胞克隆形成实验,Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞活性检测以及EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)染色等实验结果表明,miR-6778-5p能够促进结肠癌细胞的增殖。生物信息学和双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-6778-5p能够靶向调节YWHAE(14-3-3e)的表达。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)结果提示,YWHAE表达阳性与p53信号通路子集的基因特征相关。我们又利用cBioPortal数据库分析在结肠癌临床样本中,YWHAE与p53基因的表达相关性,数据显示,在mRNA水平,YWHAE与p53的表达呈正相关。通过免疫印记杂交分析了重离子照射后p53凋亡相关信号通路的变化,也进一步确认YWHAE能够通过p53介导的凋亡相关信号通路参与结肠癌细胞增殖调节。此外,为了探究引起miR-6778-5p下调的可能的分子机制,我们通过CircNet数据库预测了可能与miR-6778-5p具有相互作用的circRNAs,real-time PCR检测circRNAs的表达变化,我们发现在重离子照射后,circRNA CBL.11在结肠癌细胞中上调。AGO2免疫沉淀和生物素标记的RNA pull down实验证实了circRNA CBL.11与miR-6778-5p的相互结合作用,表明circRNA CBL.11能够通过ceRNA(competing endogenous RNAs,内源竞争RNA)机制,“吸附”miR-6778-5p并抑制其活性,从而降低了miR-6778-5p对YWHAE的抑制作用,进而上调YWHAE的表达,抑制结肠癌细胞的增殖。CCK-8细胞活性分析,EdU染色等功能性实验结果也证实了上述假设。综上所述,我们的研究结果表明,重离子辐射能够引起结肠癌细胞中circRNA CBL.11的表达上调,其可以通过miR6778-5p-YWHAE轴参与细胞增殖调节,因此,circRNA CBL.11可作为提高重离子放疗疗效的潜在靶标。


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