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《中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所)》 2019年 硕士论文
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基于高效的重离子束诱变技术选育高产L-乳酸菌株的研究

江爱莲  
【摘要】:乳酸作为二十一世纪最具有发展潜力的有机酸之一,因其在食品、医药和环保等多个领域中的广泛应用,得到了人们的日益重视。近些年来在新型生物可降解高分子材料领域的研究中,因其具有无毒、耐热性高、强度高、生物相容性好、无刺激性、优良的生物可降解性、环境污染小等优势,以L-乳酸为单体合成的聚L-乳酸(PLA)研究成为一个亮点。因而绝大部分研究学者认为此可生物降解的高分子材料在未来是非常具有发展前景的,目前已投入较多人力物力,受到国内外普遍关注。嗜热乳杆菌可在50°C以上的高温下发酵,减少了其他微生物污染,对L-乳酸工业生产极具优势。虽然利用嗜热乳杆菌生产L-乳酸非常诱人,但其L-乳酸效率和生产能力都需要进一步提高,以满足商业需求。因此如何以嗜热乳杆菌出发选育性状优良的高产L-乳酸菌株是我们研究的方向。近些年重离子束诱变选育在微生物领域具有促进作用。本文以经过重离子束辐照诱变的嗜热乳杆菌SRZ-50为初始菌株,以筛选优良菌株、提高乳酸产量、降低乳酸生产成本为三个目标进行相关实验。(1)首先在24孔板筛选方法建立完善之后,对经过重离子束辐照的原始菌株SRZ-50进行初筛,得到16株产酸较高的菌株A21、A31、A34、A37、A45、A48、A56、A57、A58、A59、A62、A68、A69、A85、A86、A87保存进行第二轮复筛实验,得到菌株A59、A69产L-乳酸较高。接着对高产乳酸菌株A59、A69进行摇瓶验证实验,所得结果与24孔板筛选结果一致,最终得到突变株A59与A69分别比原始菌株L-乳酸积累提高了15.8%和16.2%;并且突变菌株A59、A69连续7代产酸较稳定。(2)在L-乳酸发酵工艺研究中,如何降低或者消除发酵产物对L-乳酸产量和菌体生长的抑制作用是一个需要重视的问题。当前分批补料工艺已成为国内外研究的主要发酵方式,在本实验中,种子液最佳培养时间为8 h,发酵培养基中最佳初始葡萄糖浓度、最佳初始pH分别为100 g/L和pH=7。经过24h一次补料L-乳酸产量达到104.87 g/L;经过16h一次补料L-乳酸产量达到114.23 g/L;经过16h、32h二次补料L-乳酸产量达到130.67 g/L;经过四次补料且调节pH L-乳酸积累达到154.8g/L;利用Ca(OH)_2作为中和剂,得到L-乳酸产量可达到148g/L,但是相比于采用NaOH调节pH的培养基L-乳酸产量较低,所以此嗜热乳杆菌A69所用NaOH调节pH相比于Ca(OH)_2更为适合。(3)使用廉价的氮源棉籽饼粉代替酵母粉来生产L-乳酸,可以降低L-乳酸的生产成本。棉籽饼粉和酵母粉的成分类似,其中蛋白质含量较高,营养成分除蛋白质外主要是是氨基酸、维生素等物质。所以本课题以单一氮源棉籽饼粉为研究对象论证替代酵母粉生产L-乳酸的可行性。当棉籽饼粉添加量为15 g/L时,L-乳酸产量可达到76.88 g/L;在相同时间内四次补料且调节pH时L-乳酸积累产量达到131 g/L,相对于使用酵母粉的产量较低;在发酵罐中经过两次补糖,L-乳酸产量在60 h可达到110.5 g/L。本结论为确定以棉籽饼粉生产L-乳酸为此菌的工业化大规模生产打下了基础。


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