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《中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)》 2017年
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细菌反应调节蛋白RR468关键磷酸化位点的研究

王丹  
【摘要】:双组分信号转导系统是细菌体内最主要的信号转导系统,由于在人类和其他哺乳动物体内尚未发现它的存在,因此是近年来研发抗生素的热门药物靶标。反应调节蛋白是双组分信号转导系统的第二个组分,用于传递来自组氨酸激酶的信号并产生适应性反应。在整个信号转导过程中,反应调节蛋白的磷酸化和去磷酸化最终决定了该系统的信号输出和信号转导终止,因此其磷酸化和去磷酸化作用位点是控制其功能的关键要素。反应调节蛋白RR468存在于T.maritim中,基于该蛋白的表达量高、易于纯化、核磁谱图分辨率高、分散度好且其晶体结构已被解析等优点,该蛋白可以作为很好的模式蛋白进行磷酸化机制的研究。有研究报道位于反应调节蛋白两个关键loop:loop β3-α3和loop β4-α4上的两个非保守性的氨基酸残基D+2和T+2突变后会对其磷酸化和去磷酸化速率产生影响,我们将位于RR468这两个位点的残基M55和K85进行突变,通过Native-PAGE凝胶电泳功能实验证实这两个残基突变会对蛋白磷酸化和去磷酸化产生影响。CPMG Relaxation Dispersion实验研究表明M55A和K85E突变体对存在构象交换的三个loop区的构象交换速率影响并不大,说明二者对于功能的改变并不是通过对动力学性质的改变实现的。1H-15NHSQC的化学位移扰动分析发现突变对loop β4-α4和loop β5-α5两个loop的结构产生了较大的影响。我们发现位于RR468上的另一个保守性位点D+3(M56)突变成Ala后会使蛋白失去磷酸化功能,并且对蛋白动力学性质产生很大影响。我们解析了M56A的溶液结构,发现该位点的突变并没有使蛋白结构产生明显的变化,而是通过影响蛋白与Mg2+的结合影响磷酸化功能。我们进行了一系列突变,改变M56的侧链长度,随着D+3位点链长变短,蛋白的磷酸化功能逐渐减弱。该现象的产生是由于M56侧链与附近的非极性残基V8、L52、V64形成疏水口袋,该疏水口袋会影响loop区的稳定以及蛋白与Mg2+的结合,而残基的侧链变短则该疏水口袋无法形成,进而会影响磷酸化功能。反应调节蛋白的磷酸化机制一直是大家关注的焦点问题,我们通过对RR468关键位点的结构和功能研究,发现了几个参与到磷酸化过程中的关键残基。其中M56在Mg2+结合以及稳定β3-α3 loop构象中起到了极为重要的作用,阐明了Mg2+除了参与磷酸基团配位外,另一个重要功能是在磷酸化反应之前稳定蛋白β3-α3 loop区的构象,帮助蛋白形成有效的活性中心,有利于磷酸化过程的发生。我们的研究结果为反应调节蛋白磷酸化机制的进一步研究提供了理论依据和数据支持。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q51

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1 王丹;细菌反应调节蛋白RR468关键磷酸化位点的研究[D];中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所);2017年
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