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《中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)》 2017年
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新德里金属β-内酰胺酶-1的NMR研究及日本脑炎病毒衣壳蛋白表达纯化

姚陈叠  
【摘要】:随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性问题变得日益严重,其中由耐药细菌产生的β-内酰胺酶更是人们研究的热点。2009年,在印度发现一种新型β-内酰胺酶—新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)。它能够分解除了多粘菌素和替加环素外几乎所有含β-内酰胺环抗生素,这给临床医疗带来了严重的危机。虽然结构生物学家们已对NDM-1的结构展开了研究,但详细的分子作用机制仍不十分清楚。本论文利用常规核磁共振技术以及~(19)F核磁共振围绕NDM-1的溶液结构及分子作用机制展开研究。首先,制备了 ~2H/~(13)C/~(15)N三标记NDM-1蛋白样品,利用常规三共振谱对di-Zn-NDM-1(功能态)主链信号进行了归属。在以上信号指认的基础上,利用TALOS+对di-Zn-NDM-1蛋白二级结构进行了预测,结果表明溶液中di-Zn-NDM-1的二级结构与晶体结构整体一致,含有5个α-螺旋、12个β-折叠以及loop区域。该研究对后期用NMR方法获取NDM-1动力学信息提供了良好的基础。同时,也制备了 ~(19)F酪氨酸、色氨酸标记的样品,灵敏直观地监测了apo-NDM-1(无功能态)、di-Zn-NDM-1(功能态)、L-Captopril-bound-NDM-1(去功能态)的~(19)F NMR信号,并利用单点突变法对不同态的~(19)F信号进行了归属,通过核磁共振滴定实验研究了锌离子与apo-NDM-1的作用过程。~(19)F和HSQC谱均表明apo-NDM-1结合Zn2+时,活性中心附近的Loop区可能存在慢时间尺度的构象交换,这说明Zn2+可能不仅仅参与抗生素的水解过程,也可能参与调控NDM-1活性中心的动态构象变化,从而影响NDM-1催化水解过程中抗生素的结合以及其水解产物的离去。另外,本文还介绍了日本脑炎病毒衣壳蛋白(JEV-C)的表达与纯化。我们构建了删除C末端的疏水区片段(W114-A127)的衣壳蛋白表达质粒,在大肠杆菌(Ecoli)中实现了蛋白的过量表达,并利用Ni柱亲和层析、分子筛与凝血酶酶切获得了符合NMR实验要求的蛋白质样品,为用核磁共振解析解析衣壳蛋白结构、理解衣壳蛋白在病毒颗粒中的功能奠定了基础。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.31

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