HIV-1逆转录酶抑制剂筛选方法的研究

【摘要】： 逆转录酶在人类免疫缺陷病毒(HIV)的生命周期中发挥着至关重要的作用,成为目前最成功的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的治疗靶点之一,逆转录酶抑制剂在AIDS治疗中必不可少。现有药物的副作用和耐药性的快速出现使得寻找新HIV逆转录酶抑制剂的研究工作更为紧迫。天然产物是新药的重要来源,如能对天然产物粗提物进行HIV逆转录酶抑制活性筛选将极大地提高发现新HIV逆转录酶抑制剂的效率。因此,本文以发展可用于天然产物粗提物的HIV逆转录酶抑制剂的筛选方法为目标进行了研究。 首先,创新性地将异相免疫分析、时间分辨荧光检测与HIV-1逆转录酶催化的逆转录反应相结合,构建了新的HIV-1逆转录酶活性检测方法。这一方法借助digoxigenin和抗digoxigenin抗体进行捕获,可以有效避免天然产物粗提物中内源性生物素带来的干扰;检测中使用的异相时间分辨荧光技术可以有效避免天然产物粗提物自身对检测准确性带来的干扰。实验证实了其可行性。 其次,对一些重要的影响因素进行优化,并对优化后的方法进行了评价。研究表明,新方法简便、快速,可以准确定量检测HIV-1逆转录酶活性,灵敏度高,重复性好,证实所开发的方法能有效避免天然产物粗提物中内源性生物素带来的干扰,准确检测纯物质和天然产物粗提物的HIV-1逆转录酶抑制活性,而且可用于分离提取时的活性跟踪。 最后,将该方法用于海绵天然产物的研究。结果表明,该方法可以评估海洋生物粗提物的HIV-1逆转录酶抑制活性,可以用于分离前后的活性跟踪,并进而指导下一步的分离。