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《中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)》 2018年
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乳液颗粒化策略在疫苗佐剂中的应用

夏宇飞  
【摘要】:随着疫苗产业的长足发展,开发一种安全、有效的疫苗佐剂成为研究的重点和难点。针对现有临床应用的颗粒化疫苗,在功能化修饰、免疫刺激物的多级装载以及重现天然病原体柔性等方面的缺陷,本研究提出乳液颗粒化策略对疫苗进行刚性和柔性的改造,使其兼具油乳佐剂和颗粒佐剂的优势。并借助合成生物学的基本思路,利用乳液颗粒化策略提供一种颗粒疫苗合成的“底盘”(chassis)策略,以化学工程的思维,通过对不同底盘“部件”的装载(抗原、靶向及免疫刺激分子等),提供一种结构稳定、免疫活性高且广谱的新型疫苗,以应对疫苗产业发展和重大传染病应急预案等的需求。利用内向乳液颗粒化策略,对疫苗进行刚性改造,构建内部为乳滴,外部有坚硬高分子外壳的核壳复合结构,实现对抗原以及功能化成分(全反式维甲酸,retinoic acid,RA)的多级装载,同时引发有效的系统性免疫与粘膜免疫应答,拓宽疫苗的免疫保护广度。另一方面,通过外向乳液颗粒化策略,对疫苗进行柔性改造,建立颗粒稳定的乳液(Pickering乳液),开发其柔性和流动性,增大与免疫细胞的接触面积,动态地促进免疫识别和应答,提升疫苗的免疫响应深度。论文具体工作展开如下:1.内向乳液颗粒化策略,对疫苗进行刚性改造,构建硬乳液颗粒实现RA与抗原的协同递送与时空耦合性释放,促进溶酶体逃逸和交叉递呈。硬乳液颗粒(253.3 ± 35.2 nm)呈现核壳复合结构,内部为包埋RA的角鲨烯乳滴,外部为具备正电荷的PLGA/DDAB混合壳层,并实现了高RA包埋率(83.6±4.3%)和抗原吸附率(88.5±4.2%)。在溶酶体内产生“胞内熟化现象”,颗粒间聚并,产生更大粒径且更小比表面积的微囊,展现出更加优异的RA缓释性能。并且,其正电荷的表面产生“质子海绵效应”,导致溶酶体膜破裂而释放抗原。从而在胞内实现RA长效而持久的缓释,并促进抗原在细胞质途径中的交叉递呈。2.利用硬乳液颗粒构建“免疫车票”策略,通过肌肉注射的方式,同时引发系统性免疫和粘膜免疫应答。硬乳液颗粒首先募集树突状细胞(dendritic cells,DCs),并提升其对抗原的摄取及交叉递呈。通过实现抗原和RA的时空耦合性联合递送,促进RA/RAR信号通路,同时抑制RA的免疫抑制效果。其诱导DCs产生肠粘膜归巢受体CCR9,提升细胞中RALDH2酶的活性,诱导RA的分泌,进一步引发外周免疫细胞沿着体内趋化因子CCL25浓度梯度向肠粘膜免疫组织的归巢,强化粘膜免疫应答。进而,在OVA和EV71疫苗中,促进了抗原特异性IgG抗体滴度以及杀伤性T细胞的活化。并在肠粘膜淋巴组织中激活了最高水平的递呈抗原的DCs、抗原特异性杀伤T细胞以及抗原特异性粘膜抗体IgA的响应,具备同时激活系统性和肠粘膜免疫应答的佐剂效应。3.利用外向乳液颗粒化策略,对疫苗进行柔性改造,构建模拟病原体柔性和流动性的Pickering乳液(PPAS)。PPAS具备颗粒吸附的表面,为抗原吸附提供了巨大的比表面积,大大提升了抗原的载量,模拟出了病原体表面抗原密集而重复的排列,有利于其更好地刺激免疫应答。并且,其可以在细胞膜表面发生柔性形变,增大了与免疫细胞表面的接触面积。在接触区域内,PPAS上的抗原可以在缝隙中流动,从而动态地激活免疫细胞的识别和摄取,具备提升免疫效果的佐剂潜力。与此同时,PPAS具备良好的室温储存和冻融稳定性,利于大规模生产和临床应用。4.PPAS增强抗原内吞以及交叉递呈,通过募集并激活APCs,以及促进淋巴结成熟来提升免疫应答。PPAS强化抗原摄取以及共刺激分子CD86的表达。在溶酶体的酸性条件下,PPAS表面羧基发生质子化而使其表面电荷翻转呈正电荷,致使溶酶体内膜不稳定而破裂,实现溶酶体逃逸,促进抗原的交叉递呈。PPAS在注射部位形成抗原储库效应,有效募集APCs并促进其活化和交叉递呈。并且,刺激APCs向淋巴结归巢,实现抗原在淋巴结中大量而长效的富集,促生发中心活化,引发高效适应性免疫响应。5.PPAS在OVA、H1N1流感疫苗以及MUC1抗肿瘤短肽疫苗中展现出优异的预防性和治疗性免疫佐剂效果。与商品化佐剂相比,PPAS有效激活体内抗原特异性抗体IgG的表达,以及抗原特异性杀伤T细胞的活化。在预防性效果表征中,PPAS得到了最高的HIN1流感病毒和E.G7/OVA淋巴瘤细胞的攻毒保护率。在肿瘤治疗方面,PPAS可以有效调动脾细胞中IFN-γ分泌T细胞的活化和增值,显著杀伤肿瘤,并抑制MUC1/B16黑色素瘤以及E.G7/OVA淋巴瘤细胞的生长,提升荷瘤小鼠生存率。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ464

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