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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2011年
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皱纹盘鲍4种多糖裂解基因的表达研究

何庆国  
【摘要】:皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)是名贵养殖贝类。皱纹盘鲍主要以藻类为食,幼体皱纹盘鲍主要摄食卵形藻(Cocconeis sp)、舟形藻(Navicula sp)、菱形藻(Nitzschia sp)等底栖硅藻、而成体皱纹盘鲍则主要摄食大型海藻,尤其喜食海带(Laminaria japonica)。多糖类物质是藻类的主要组分,比如硅藻含纤维素和淀粉,海带含纤维素、褐藻胶和海带淀粉。 本研究利用实时荧光定量PCR技术在转录水平研究不同生长、发育阶段皱纹盘鲍体内褐藻酸酶(hdaly)、纤维素酶(hdcel)、α-淀粉酶(hdamyl)和海带淀粉酶(hdlam)等多糖裂解酶基因的定量表达,同时分析了不同温度下长期培育的皱纹盘鲍体内多糖裂解酶基因的表达变化。旨在通过对4种多糖裂解酶基因表达的定量研究,揭示皱纹盘鲍在不同发育阶段和生理状态下对食物中各种多糖类物质的利用情况。现将主要结果摘要如下: 1.皱纹盘鲍4种多糖裂解酶基因序列及表达的组织特异性 根据已发表的盘鲍或皱纹盘鲍多糖裂解酶基因及皱纹盘鲍内参基因β-actin的cDNA序列信息设计适合实时荧光定量分析的特异性扩增引物,以皱纹盘鲍的DNA和cDNA为模板分别进行扩增,将扩增产物克隆、测序。以cDNA为模板分别得到褐藻酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶、海带淀粉酶和β-actin基因的扩增产物116、162、188、177和175bp,及以DNA为模板的扩增产物116、829、626、177和175bp。生物信息学分析表明:(1)以cDNA为模板扩增得到的褐藻酸酶、α-淀粉酶、海带淀粉酶及β-actin基因的序列与已发表的盘鲍(Haliotis discus discus Reeve)或皱纹盘鲍的相应序列完全一致,而纤维素酶基因则存在2个潜在的SNP位点,结果表明,我们设计的引物扩增到了相应的目的产物;(2)在纤维素酶和α-淀粉酶的基因组序列中分别扩增得到667bp,438bp的内含子序列。 采用上述引物分别对成体皱纹盘鲍的鳃、肌肉、触角、外套膜和消化腺等组织样本进行定量分析,结果表明,4种多糖裂解酶基因均主要在消化腺中表达,其他组织中未检测到产物或表达量极低。 2.皱纹盘鲍多糖裂解酶基因在不同发育阶段的表达变化 我们比较了皱纹盘鲍幼体、幼鲍和成体阶段4种多糖裂解酶基因的表达变化。 从受精卵到45日龄稚鲍的发育过程中,4种多糖裂解酶基因均有表达,且表达量在整个过程中均表现为先下降后上升的趋势,上升阶段基因的表达量分为三个水平。结果如下:0h-6d的早期胚胎发育阶段,4种多糖裂解酶基因的表达量均处于较低的表达水平,表现为先下降后上升的趋势,在24h处于最低点。7d-22d和30d-45d发育阶段,基因的表达量增加缓慢,但7d-22d表达量显著高于0h-6d的表达量,30d-45d表达量显著高于7d-22d的表达量。 饵料转换期4种多糖裂解酶基因的表达量呈现先下降后上升的趋势,其表达量在剥离后24h内急剧下降,24h后表达量开始上升。 3.不同温度下长期培育的皱纹盘鲍体内多糖裂解酶基因的表达变化 设置7个温度处理:分别为8℃、12℃、16℃、20℃、22℃、24℃和30℃处理组,每个温度内设置3个重复。每个重复初始投放壳长在2.3cm左右的稚鲍70头,循环水系统中自然海水温度下适应一周之后,开始逐渐升/降温(1℃/日)操作,直至达到实验要求的目标温度,之后恒温培养。取消化腺RNA,采用实时荧光定量PCR技术,对4种多糖裂解酶基因的相对表达量进行分析。结果显示:不同温度下长期培育的皱纹盘鲍体内4个多糖裂解酶基因的表达量具有显著差异。在7个温度处理中,24℃时具有最高的相对表达量,8℃~24℃时,随着温度的升高,基因的相对表达量也随着升高,而24℃~30℃时,各基因的表达量呈下降趋势。
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