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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2011年
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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究

刘媛  
【摘要】:三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高,由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重,给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究,探索免疫防治新途径,是实现其健康养殖的可靠保障。本研究构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,利用表达序列标签技术(EST),对三疣梭子蟹表达序列进行大规模测序分析,从中鉴定免疫相关基因,并利用cDNA末端快速扩增(RACE)、实时定量PCR、基因原核重组表达等技术系统研究三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型,确定抗脂多糖因子cDNA和基因组序列结构,分析其前体mRNA剪接方式,探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。 本研究成功构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,库容分别是8.0×105和5.6×105克隆。从血细胞文库中随机测序获得4452条高质量的EST序列,经拼接得到1066条Unigenes,包括461条Contigs和605条Singletons。从眼柄文库中随机测序获得4606条高质量的EST序列,可拼接为510条Unigenes,包括301条Contigs和209条Singletons。通过BLAST比对发现,血细胞文库中660条Unigenes、眼柄文库中365条Unigenes与Genbank数据库中的基因有较高同源性。进一步分析发现,血细胞文库中64条Unigenes、眼柄文库中35条Unigenes与免疫相关。这些基因可分为6类,分别是抗菌肽、氧化还原蛋白、黑化反应相关蛋白、分子伴侣蛋白、凝集因子和其它类别。其中,有5种免疫相关基因都存在多种相应的蛋白亚型,即抗脂多糖因子(PtALF1-7)、Crustin(PtCrustin1-3)、硫氧还蛋白(PtTrx1-2)、带有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(PtcSP1-5)和Kazal型蛋白酶抑制剂(PtKPI1-4)。EST序列的获得和免疫基因的富集,丰富了三疣梭子蟹的基因组信息,为进一步克隆和研究三疣梭子蟹免疫防御功能基因奠定基础。 本研究在EST分析基础上,克隆得到三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型PtALF1-7。它们的开放读码框编码的蛋白均含有一段信号肽、两个保守的半胱氨酸残基,与相近物种的ALF均具有较高同源性。与大多数报道的ALF晶体结构类似,PtALF2、PtALF3、PtALF5和PtALF7预测的空间结构由4个β折叠片和3个α螺旋组成,而PtALF1蛋白的空间结构中仅包含1个α螺旋,PtALF4蛋白的空间结构中含有5个β折叠片。序列分析表明PtALF1-3是由同一个基因组位点编码,经mRNA前体可变剪接产生。PtALF4-7分别由不同的基因组位点编码。在PtALF4、PtALF5和PtALF7基因的内含子区域均发现串联重复序列。通过直接测序,在PtALF1-3和PtALF7基因组序列中分别发现89个和128个SNP位点。PtALF1-7基因在健康三疣梭子蟹各个检测组织中均有表达,但是呈不同的表达模式。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌刺激后,PtALF1-7基因的表达量随时间变化明显,提示PtALFs是清除入侵病原菌的快速应答因子和持续效应因子。三疣梭子蟹抗脂多糖因子在大肠杆菌中表达情况并不理想,重组的PtALF5经抑菌试验证明没有活性,PtALF3和PtALF7在加入IPTG的诱导初期对大肠杆菌具有强烈的抑制作用。以上研究结果揭示三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其亚型的分子基础、组织分布特点及对微生物的响应机制,为全面理解抗脂多糖因子及其亚型的结构和功能奠定了良好基础。
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